Adv. Mater.：金属-多酚配位纳米药物协同级联癌症化疗和化学动力治疗

NanoLabs

2019-12-16

第一作者：Zhigang Ren

通讯作者：阚全程、余祖江、毛峥伟

通讯单位：郑州大学第一附属医院、浙江大学

研究亮点：

1. 利用金属-多酚配位作用制备了EGCG与Pt-OH相结合的有机纳米治疗药物，具有载药量高、生物相容性好、稳定性强、血液循环时间长的优点。

2. PTCG NPs细胞内化后，释放抗癌药物，并通过级联反应产生活性氧，实现化疗/化学动力协同治疗。

3. 通过在PTCG NPs中掺杂Gd，成功引入了成像功能来监测纳米药物的传递和释放行为，赋予了纳米药物诊断能力。

背景介绍：

化疗在临床上被广泛用于治疗多种癌症。铂(II)基药物，包括顺铂、奥沙利铂和卡铂，是目前使用较为广泛的一线癌症治疗药物。许多以铂(II)配合物为基础的纳米药物已被开发出来，旨在通过充分利用主动靶向以及EPR效应，实现肿瘤特异性递送。然而，这些纳米药物的治疗效果并不理想，还需在纳米制剂中加入更多的治疗方式，以提高其抗癌效果。

作为一种新型杀死癌细胞策略，基于芬顿反应的化学动力学疗法（CDT）成为癌症治疗的新方法。芬顿反应利用金属催化细胞内过氧化氢(H₂O₂)向活性氧物种(如超氧自由基O₂·⁻和羟基自由基·OH)转化，因此，体内疗效高度依赖于内源性H₂O₂的量。顺铂可以在癌细胞中特异性激活NADPH氧化酶（NOX），O₂接受NADPH氧化为NaDP⁺所给予的电子，形成O_2·⁻，再被超氧化物歧化酶进一步歧化生成H₂O₂。因此，以顺铂为主的化疗通过自给H₂O₂进行Fenton反应，是CDT的理想方案。

纳米氧化铁已被用作CDT的药物载体和铁源，但其相对较低的载药量和较慢的铁释放可能会削弱其抗肿瘤作用。与无机治疗药物不同，由有机基元构建的纳米药物具有无可比拟的优势，包括生物相容性、生物降解性、高载药量和刺激响应性，在临床转化方面具有巨大的潜力。

成果简介：

有鉴于此，郑州大学第一附属医院阚全程和余祖江研究团队联合浙江大学毛峥伟研究团队基于铁离子(Fe³⁺)与多酚的配位作用，将表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与5-羟基多巴胺修饰的铂(IV)前药(Pt-OH)复合，制备了有机纳米治疗药物(PTCG NPs)。设计了一种含有多酚链段的嵌段共聚物(PEG-b-PPOH)来对纳米粒子(NPs)进行PEG化，从而延长了纳米粒子的循环时间，抑制蛋白质吸收，并增强了所获得的纳米药物的肿瘤蓄积。由于Fe³⁺和多酚基团之间的强配位作用，PTCG NPs中负载的Pt-OH和EGCG的比例可以精准调整到治疗水平，从而实现协同效应。纳米颗粒可以掺入钆离子(Gd³⁺)，用于磁共振成像(MRI)，以追踪PTCG NPs的体内释放。在低pH环境下，由于亚胺连接体的裂解和Pt-OH活化为顺铂，活性药物被HepG2细胞内化后有效地从纳米粒中释放出来。产生的顺铂通过级联反应提高了细胞内H₂O₂水平，在Fe³⁺的催化下产生有毒的ROS，从而可通过CDT来提高疗效。

 图1. PTCG NPs作用机理图

要点1. PTCG NPs的制备

通过三步反应合成了嵌段共聚物PEG-b-PPOH，EGCG和Pt-OH被PEG-b-PPOH高度包裹，负载量高于30%，由于金属-多酚之间强大的配位作用，两种治疗剂可有效地共包裹到纳米颗粒中，在最佳比例下，负载率高达90%。值得注意的是，通过在制备过程中改变EGCG和Pt-OH的百分比看调整组件的流体动力学直径，实验验证，EGCG和Pt-OH最佳配比为1：4。

图2. PTCG NPs的表征

要点2. PTCG NPs的体外释放和细胞摄取

在此纳米药物中，低pH值和谷胱甘肽(GSH)能裂解共聚物和Pt-OH上的多酚，促进细胞内化后药物释放和活化。血液中GSH浓度低，pH值较高，保证了PTCG NPs在循环过程中的稳定。而肿瘤细胞中较高浓度的GSH和较低的pH能有效地将活性顺铂和EGCG释放到细胞内。

PTCG NPs主要通过网织蛋白介导的内吞作用内化，辅以小凹和大胞吞噬途径。通过激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)可观察到PTCG NPs被细胞有效摄取。

图3. 细胞实验结果

要点3. PTCG NPs的体外抗肿瘤效果

以顺铂为对照，采用MTT实验评价PTCG NPs的抗肿瘤效果。与EGCG、Pt-OH或EGCG与Pt-OH混合物孵育的HepG2细胞相比，PTCG NPs处理的HepG2细胞的凋亡率和坏死率明显增高，证实了PTCG NPs的协同抗肿瘤作用。

有趣的是，释放的顺铂能够通过级联反应介导NOX的活化，将O₂触发为O₂·⁻及其下游的H₂O₂。通过负载的Fe³⁺催化Fenton反应，将H₂O₂催化成剧毒的·OH，从而放大细胞内的氧化应激，实现额外的CDT。用2,7-二氯二醋酸荧光素作为荧光探针证明了HepG2细胞内ROS的产生。并通过实验验证了铁和顺铂联合作用对ROS生成的放大作用。

 图4. 血液循环、组织分布、MRI成像结果

要点4. PTCG NPs的药代动力学行为和生物分布

对PTCG NPs的药代动力学行为和生物分布进行评估。采用电感耦合等离子体质谱法和高效液相色谱分别测定血液中随时间变化的铂和EGCG含量，计算PTCG NPs的循环时间。EGCG或Pt-OH迅速从血液中清除，其循环半衰期分别为0.44±0.06h和0.39±0.05h。与此形成鲜明对比的是，PTCG NPs中两者的循环半衰期分别为2.92±0.22h和3.27±0.38h，表明PTCG NPs的循环时间明显延长。

要点5. PTCG NPs掺杂钆离子（Gd³⁺）实现MRI成像

将成像/诊断功能结合到纳米系统中对癌症进行早期诊断，更好地了解和优化药物输送，监测治疗效果和治疗后的反应是非常重要的。MRI是临床诊断和临床前研究中广泛使用的最重要的成像手段之一，具有无创检测，无辐射副作用，以及高空间分辨率的优势。在制备纳米药物的过程中，引入Gd³⁺掺杂PTCG NPs而不改变其尺寸，可达到MRI成像目的。

要点6. PTCG NPs的体内抗肿瘤效果和全身毒性

利用HepG2荷瘤裸鼠对PTCG NPs的体内抗肿瘤作用进行研究。与PBS对照组相比，EGCG NPs组小鼠的治疗效果有限，EGCG+Pt-OH抗肿瘤效果也较差，而PTCG NPs对小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用，这主要归因于EPR效应、刺激反应性药物释放、ROS升高、及化疗/化学动力学治疗协同抗癌作用。

且PTCG NPs组小鼠存活时间更长，与健康小鼠相比，PTCG NPs未见明显的组织损伤或炎性病变，也未检测到明显的炎性免疫细胞聚集，说明PTCG NPs在体内应用是安全的。为进一步评价PTCG NPs在体内的长期潜在毒性，采集小鼠血液进行血液生化检测，健康小鼠和PTCG NPs处理的小鼠均未检测到特定参数的明显变化，且注射PTCG NPs的小鼠的其它血液学指标均在正常范围，表明此纳米技术可避免全身毒性。

图5. 体内抗肿瘤效果和全身毒性结果

小结：

综上所述，此研究利用金属-多酚配位作用制备了EGCG与Pt-OH相结合的有机纳米治疗药物。PTCG NPs具有较高的载药能力，在生理环境中表现出优异的稳定性。在细胞内化后，通过级联反应，特异性打开癌细胞闸门，释放抗癌药物和活性氧，实现化疗/化学动力联合治疗。在PTCG NPs中掺杂Gd，成功地引入了成像功能来监测纳米药物的传递和释放行为，赋予了纳米药物诊断能力。体内实验则证实了PTCG NPs的协同抗肿瘤性能和良好的生物相容性。与绝大多数传统给药系统相比，这种金属-配体杂化大大提高了抗癌效果，丰富了所得纳米药物的治疗功能。这一开创性的工作为治疗纳米药物的发展提供了新策略，这些药物在癌症治疗领域具有较高的潜力。

参考文献：

Zhigang Ren, Shichao Sun, Ranran Sun, et al. A Metal–Polyphenol‐Coordinated Nanomedicine for Synergistic Cascade Cancer Chemotherapy and Chemodynamic Therapy. Adv. Mater., 2019.

https://doi.org/10.1002/adma.201906024