谭蔚泓/刘艳岚JACS：新型适配体药物共轭物，改进肿瘤化学动力学治疗

NanoLabs

2019-12-24

第一作者：Wenjing Xuan, Yinghao Xia

通讯作者：谭蔚泓，刘艳岚

通讯单位：湖南大学

研究背景:

自由基是一组在几乎所有类型的细胞中产生的活性化学底物，是各种低水平生物过程中不可缺少的管理者。实际上，自由基理论已经有五十多年的历史了。然而，仅仅在过去的十年里，人们才进行了广泛的研究，以探索它们在包括癌症在内的疾病发展中的关键作用。与正常细胞不同，癌细胞通常在其一生中过度产生自由基，主要是过氧化氢（H₂O₂），以促进肿瘤的快速增殖、转移和其他事件，这是由代谢重编程引起的。然而，自由基是一把双刃剑，这样跨越自由基水平的阈值将导致不可逆转的氧化损伤，最终导致细胞死亡。具有讽刺意味的是，癌细胞中高水平的固有自由基也使它们比正常细胞更容易受到额外的氧化攻击。因此，化学动力学疗法（CDT）是一种新的、比传统疗法更有效的治疗多种癌症的方法。

到目前为止，我们已经致力于开发各种CDT治疗癌症的策略。本质上，这些方法基本上依赖于经典的Fenton或Haber-Weiss反应，通过过渡金属将外源性低反应H₂O₂转化为抗癌羟基自由基（žOH）。然而，在这些过程中，有两个关键瓶颈作为限制因素，它们对CDT原本广泛的抗癌应用产生了重大影响。一个与化学反应动力学有关。众所周知，高Fenton和Haber-Weiss反应速率要求很低的pH值（pH 2-4），使得它们在肿瘤微环境（TME）下难以充分利用。另一个原因是肿瘤间外源性过氧化氢水平的不均一性，导致消耗过氧化氢治疗效果不足，显著降低。更糟糕的是，癌细胞上调抗氧化防御（主要是谷胱甘肽）以适应自由基引起的氧化损伤，揭示了另一个挑战，以提高治疗效率。

因此，对于最大化的治疗效果和最小化的安全关注，理想的化学动力学药物应该至少满足以下特征：（i）肿瘤靶向积累对正常的氧化还原信号的影响可忽略不计；（ii）用于定点释放的简便和空间控制的化学反应有害的自由基；（iii）较少的肿瘤毒性氧自由基的形成依赖于肿瘤ROS；（iv）癌性抗氧化防御的同时耗尽，以及（v）良好的生物相容性、可生物降解性和质量控制。然而，据我们所知，一种能够满足所有这些标准的治疗方法仍然是难以捉摸的。

成果简介:

近日，湖南大学谭蔚泓、刘艳岚等人提出了一个新的概念，即生物正交化学和前体药物相结合，创造一种新型的适配体药物共轭物（ApDC）：适配体前体药物共轭物（ApPdC）胶束，用于改进癌症靶向CDT。疏水性前药碱不仅可以促进适体的自组装，而且还可以通过生物正交化学作为自由基生成剂。深入的机理研究表明，与传统的CDT系统不同，ApPdC微粒通过级联生物正交反应使癌细胞中的有毒C-中心自由基原位激活和自循环生成，不依赖于既不含H₂O₂也不依赖pH。同时，谷胱甘肽耗竭减少了癌的抗氧化作用，产生协同的CDT效应。我们期望这项工作能为癌症靶向治疗的设计和自由基相关分子机制的研究提供新的见解。

总体思路:

在此，首次报道了生物正交化学和前药设计的引入，以产生一种新型的适配体药物共轭物（ApDC）：适配体前体药物共轭物（ApPdC）胶束，其能够TME双靶向和自循环，用于原位扩增在癌细胞中产生的毒性自由基。工程化的ApPdC胶束由三部分组成：适体作为肿瘤识别单元，Fe²⁺可激活的四氧烷（“T”）作为自由基前体药物，以及氯高铁血红素作为TME反应的Fe²⁺原位活化源。

图1. 示意图

要点1：ApPdC的合成与分子组装

成功地合成了一种新的靶向抗癌药物，将前体药物和生物正交化学相结合，以靶向肿瘤细胞氧化还原稳态失调为靶点，用于增强和靶向化疗。凝胶电泳分析表明，AS1411分子量增加，胶束结构导致电泳迁移率降低，呈现明亮而致密的条带，而Ap-6G-T分子量增加，出现一条模糊的条带。原子力显微镜（AFM）进一步证实了这一特性，显示出均匀且单分散的球形结构，平均尺寸为32.4nm。动态光散射（DLS）和Z电位测定表明，Ap-6G-T胶束在生理条件下是稳定的、带负电的，没有明显的聚集现象。

 图2. （A）“T”的合成示意图;（B）凝胶电泳分析;（C,D）DLS分析、AFM成像和Z电位

要点2：血清和核酸酶稳定性

由于充分的血清耐受性是决定一种新开发的抗癌药物是否可用于体内应用的先决条件和关键因素，随后对ApPdC胶束的稳定性进行了检查。为此，首先在37℃的90%磷酸盐缓冲血清溶液中分析由Ap-6G-“T”、Ap-6G-2“T”或Ap-6G-3“T”组成的不同ApPdC胶束。作为参考，还评估了“T”自由适配体。发现游离的适配子在48小时的孵育后迅速降解，只剩下不到40%的适配体（图2A，B）。令人印象深刻的是，在相同条件下与前药碱偶联后，其稳定性显著提高，70%以上的偶联物残留，从而显示其对血清介导的降解具有较高的抗性。

图3. 琼脂糖凝胶分析和定量分析自由适体和不同ApPdC胶束在FBS（A,B）或核酸酶（C,D）中的降解速率

要点3：激活机制

我们进行了全面的机制研究，以提高我们对工程化ApPdC胶束的癌细胞特异性激活和治疗活性的基本认识。我们的研究结果表明，AppDC胶束中的前药基础可以被细胞内Fe²⁺激活，从而触发级联的生物正交反应，用于原位扩增产生有毒的C-中心的自由基。

 图4. （A）游离Fe²⁺或（B）血红素（Fe²⁺）介导的前药碱“T”的激活机制

要点4：癌细胞识别与毒性自由基的原位生成及癌细胞的协同细胞毒性

强疏水性前药碱允许在ApPdC胶束中装载血红素。肿瘤细胞内GSH的升高可将负载的氯高铁血红素还原成血红素，从而为促进充分的生物正交反应提供了Fe²⁺自供平台。值得注意的是，这样的自由基生成过程优于传统的细胞疗法，不依赖于强酸性pH值或内源性H₂O₂，同时通过消耗GSH同时减少癌性抗氧化。以AS1411为模型适体，系统评价了ApPdC胶束对癌细胞自由基的特异调节作用。我们的数据表明，ApPdC胶束可以通过受体介导的靶向性特异性识别癌细胞，与非靶向胶束相比，增强了细胞的摄取。胞吞作用后，ApPdC胶束能比非靶向胶束更有效地产生毒性自由基，对癌细胞有显著的氧化损伤和增强的抗增殖作用。更令人印象深刻的是，这样的抗癌效果可以通过合用血红素或增加ApPdC链中前药碱的数量来增强。

 图5. 流式细胞术（A）和共焦荧光成像 （B）分析不同ApPdC和非靶胶束在HepG2细胞中的结合能力 （C）自由适配体和ApPdC胶束的溶酶体共域化

图6. 不同处理HepG2细胞自由基水平的流式细胞术（A）和共聚焦荧光成像（B）

小结:

虽然本人的研究结果显示了很好的治疗前景，但仍需要进一步的研究，例如ApPdC胶束的体内药代动力学和抗癌功效，以更好地说明其治疗癌症的潜力。此外，尽管ApPdC胶束被设计用于靶向独特的癌细胞代谢以减少副作用，但未来仍需要更多的研究来评估对正常细胞或组织的长期安全性问题。然而，由于铁代谢紊乱和氧化应激的易感性代表了癌症之间的共同特征，这项研究可以为开发新的有效的AppDCS奠定基础，以特异性治疗各种晚期癌症。

参加文献及原文链接:

Wenjing Xuan, Yinghao Xia, Ting Li, et al. Molecular Self-assembly of Bioorthogonal Aptamer-Prodrug Conju-gate Micelles for Hydrogen Peroxide and pH-Independent Cancer Chemodynamic Therapy. Journal of the American Chemical Society, 2019.

DOI: 10.1021/jacs.9b10755

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.9b10755