Nature Nanotech：器官选择性靶向纳米颗粒，去哪个器官它来sort（附专访）

奇物论

2020-04-09

第一作者：程强，魏妥

通讯作者：Prof.Daniel J. Siegwart

通讯单位：美国德克萨斯大学西南医学中心

CRISPR/Cas介导的基因编辑和基于信使RNA（mRNA）的蛋白质替代疗法具有巨大潜力，可以有效治疗具有多种细胞起源的致病突变。如果还不太了解的CRISPR/Cas如何起作用的同学，可以出门左转，点击今天推送的第三条的科普视频哦！

非病毒载体具备无传染性、没有载体容量限制、材料来源广泛、化学结构可控制等优点，有着病毒载体不可替代的作用。其中，脂质纳米粒（LNPs）可以将治疗性核酸递送至肝脏。现有的研究工作尽管取得了一些进展，但是最大的问题是尚无法预测和合理地设计出选择性靶向特定组织的纳米颗粒，以完成mRNA安全高效的递送至肝脏以外的其他组织。

近日，美国德克萨斯大学西南医学中心Daniel J. Siegwart教授课题组报道了一种器官选择性靶向（SORT）技术，对纳米粒子进行系统设计，用于mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑。这种方法可将mRNA，Cas9 mRNA /单向导RNA（sgRNA）和Cas9核糖核蛋白（RNP）等复合物准确递送到小鼠的肺、脾和肝脏内（图1a）。

相关研究成果发表在Nature Nanotechnology上，题为“Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specificmRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing”。另外，NatureNanotechnology杂志同时刊登了Roy van der Meel关于该项工作的评论性文章，题为“Nanotechnology for organ-tunable gene editing”。

图1 | SORT技术可将mRNA准确递送至特定器官

研究亮点：

1.SORT技术提供了可预测地、精确地、快速筛选器官选择性LNPs的方法，具有广泛适用性，不依赖于LNPs的类型和脂质的化学结构。

2.SORTLNPs实现了器官特异性mRNA的安全高效递送和CRISPR/Cas9介导的基因编辑治疗，并将极大地推动这些领域的发展。

要点1：SORT技术的发现和发展

一般而言，有效的细胞内递送材料依赖可电离胺结合和释放RNA以及纳米粒子稳定的疏水性之间的平衡。受该组之前的研究工作的启发：经过表面电荷调节的mRNA脂质体可以促进免疫单核吞噬细胞向树突细胞递送，研究人员推测脂质纳米粒内部的电荷可能是调节组织趋向性的关键因素。为了验证这一猜想，研究人员首先在课题组之前建立的LNP体系（mDLNP）中添加了第五种脂质分子（阳离子DOTAP），用来调节内部电荷。在不破坏原有四种组分比例（5A2-SC8 : DOPE: Chol : PEG = 15:15:30:3）的前提下，调节DOTAP的比例从0变化到100%，制成一系列的具有不同DOTAP比例的LNPs。

然后，研究人员通过静脉注射包含荧光素酶mRNA（0.1mg/kg）的纳米粒子来评估SORT效果。他们惊奇地发现，DOTAP的摩尔百分比是调整组织特异性的关键因素。随着DOTAP摩尔百分比的增加，荧光素酶蛋白表达逐渐从肝脏转移至脾脏，然后转移至肺部，表现出明显而精确的器官选择性递送趋势（图1b）。

具体为：0％DOTAP为最佳肝脏转染，10-15％适合脾脏转染，而50％为最佳肺部转染。为了验证包含其他分子也可能改变器官选择性的假设，研究人员接下来引入了阴离子脂质18PA，结果显示其比例在10％-40％时，LNPs可以完全选择性地递送到脾脏。（图1e）。这些分子通过调节LNPs内部的电荷从而调节靶向器官的选择性，研究人员将这种技术命名为SORT。SORT分子的化学性质和百分比决定了组织的特异性递送。

图2 | SORT技术不依赖于LNPs的类型和脂质的化学结构

要点2：SORT技术广泛适用于多种LNP类型和分子类别

那么，SORT技术是否同样适用于其他LNP类型呢？研究人员首先对FDA批准的siRNA标准递送载体，一种基于DLin-MC3-DMA、DSPC、Chol和DMG-PEG的LNPs，分别引入DOTAP和18PA脂质。结果与预期相符，经过SORT技术优化后的DLin-MC3-DMA LNPs的器官选择性和mDLNP的一致。此外，研究人员同样在C12-200 LNPs的研究中观察到类似的结果。这些结果表明SORT技术广泛适用于多种LNP类型（图1f,g）。

然后，研究人员评估了多种阳离子、阴离子、两性离子和可电离阳离子用作SORT技术脂质的效果。他们选用DOTAP、DDAB、EPC等作为阳离子脂质，18PA、14PA、18BMP作为阴离子脂质，调节其比例进行研究。结果发现，阳离子SORT脂质均使得转染从肝转移到脾，然后转移到肺（图2a）；而阴离子SORT脂质均促进脾脏转染（图2b）。这说明该SORT技术与脂质的化学结构和分子类别无关。另外，研究人员还发现SORT可以“激活”原本不活跃的LNPs，即引入可离子化的脂质可以“补充”原本无活性的LNPs，从而选择性递送至特定器官，甚至提高转染效率。

这些结果都表明，SORT技术广泛适用于多种LNP类型和分子类别，而且具有可控性和可预测性，成为实现器官靶向递送的一种模块化的通用策略。

图3 | SORT LNPs通过Cre mRNA递送实现特异性tdTom激活

要点3：SORT技术参与基因编辑和器官特异性治疗

鉴于SORTLNPs靶向特定器官的能力，研究人员将结果应用于组织特异性基因编辑。他们首先使用以肝、肺和脾为靶向的SORTLNPs递送Cre mRNA至转基因的tdTom小鼠中进行基因编辑，该mRNA产生Cre酶并切除终止位以激活tdTom，使其表达红色荧光（图3a）。流式结果显示，单次静脉注射0.3 mg/kg的Cre mRNA后，肝靶向的SORT LNPs对肝细胞的基因编辑效率高达93％，肺靶向的SORT LNPs对肺的上皮细胞和内皮细胞的基因编辑效率分别达到40％和65％；脾靶向的SORT LNPs对巨噬细胞的编辑效率为20％（图3e）。由于选择性的提高，脾靶向的SORT LNPs可用于治疗非霍奇金氏B细胞淋巴瘤和其他免疫疾病。尽管该研究最初的重点是单次、小剂量注射，但研究人员注意到通过给予更高剂量或多次注射可以实现更高水平的转染。

接下来，研究人员研究了SORT LNPs用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的效果，即在单个纳米颗粒中同时递送Cas9 mRNA和sgRNA（图4a）。在一次静脉注射肝和肺靶向的SORT LNPs十天后，在mDLNP和20％DODAP SORT LNPs处理的小鼠的肝脏中，以及在50％DOTAP SORT LNPs处理的小鼠的肺中均观察到强tdTom荧光，所有结果与荧光素酶mRNA递送结果一致（图4b,c）。然后，研究人员还测试了SORT LNPs编辑内源性基因（PTEN）的能力。一次静脉注射包载有Cas9 mRNA和sgPTEN的肝和肺靶向的SORT LNPs十天后，在肝和肺部的基因编辑效率可分别达到13.9%和15.1%！最后，为了确定SORT LNPs可以有效地编辑与治疗相关的靶标，研究人员同时递送Cas9 mRNA和靶向PCSK9的sgRNA（图4h），结果表明20％的DODAPSORT LNPs的基因编辑效率可达60％（图4i，j），且肝脏和血清中PCSK9蛋白水平降低约100％（图4k,l）。

以上结果都表明，SORT技术可以有效实现使用合成载体的器官选择性基因编辑。 

图4 | SORT LNPs介导器官特异性CRISPR/Cas基因编辑。

小结：

SORT技术的发现实现了将RNA纳米颗粒可预测地靶向传递到特定器官，有望推动蛋白质替代和基因校正疗法的发展。该技术可广泛应用于现有的多种类型的LNPs和其他纳米粒子系统。SORT优化的LNPs实现了器官特异性mRNA的安全高效递送和CRISPR/Cas9介导的基因编辑治疗，预期SORT可以为基因校正疗法开辟新的发展途径。

参考文献及原文链接：

Cheng,Q., Wei, T. et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticlesfor tissue-specific mRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing. Nat.Nanotechnol. 2020.

https://doi.org/10.1038/s41565-020-0669-6

通讯作者：

DanielJ. Siegwart是德克萨斯大学西南医学中心的副教授。他的研究计划专注于开发先进的基于聚合物和脂质的系统，该系统可精确控制大分子的结构、顺序和响应性，以用于药物输送、成像、遗传疾病和癌症。他是ReCode Therapeutics公司的共同创始人，致力于修饰tRNA负载的纳米颗粒，用于纠正引起囊性纤维化和其他疾病的无义突变。

对第一作者专访：

程强博士和魏妥博士为本文的共同第一作者，他们均是Daniel J. Siegwart课题组的博士后研究员。以下是奇物论编辑部对他们的专访：

1.请问您的课题组目前主要从事哪些方面的研究？

程强，魏妥：我们目前在西南医学中心Daniel J. Siegwart教授实验室从事博士后研究。Siegwart教授实验室主要从事RNA纳米药物的研究，这些RNA药物包括siRNA，miRNA和mRNA。简单来说，首先是通过合理的设计和化学合成得到一系列新型脂质分子，随后与其他必须的脂质分子及RNA药物组装成新型脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles，LNPs），用来进行疾病的治疗和预防。siRNA和miRNA用来治疗由于某些基因过量表达引起的疾病；mRNA用来治疗由蛋白质突变引起的疾病以及通过Cas9 mRNA介导的手段进行基因编辑等。但是脏器选择性RNA递送一直都是RNA治疗的研发难题，针对这一问题，我们最近通过优化LNPs的方法，研发了SORT技术，从根本上解决了这一技术难题。

2. 您觉得这个研究工作相比于之前的mRNA治疗手段的核心优势在哪里？

程强，魏妥：安全、高效的体内递送是mRNA有效治疗的核心步骤，研发肝脏靶向的LNPs较为成熟，然而突破肝脏以外的靶向递送亟待解决。当前的研发手段大多是通过化学合成进行高通量筛选，该方法有非常明显的优点，即有可能发现新型LNPs，实现其他器官的靶向递送，如，肺和脾；但缺点也非常突出，耗时、耗力、耗钱，同时具有很大的盲目性。SORT技术给出了LNPs器官靶向递送的通用指导原则，将会简化这一研发过程，且无需进行大规模体内外筛选。更重要的是，SORT LNPs可以高效递送mRNA，保证了后续mRNA治疗或者基因编辑的效果。

3. 在研究过程中，遇到过什么困难？

程强，魏妥：不偏不倚地说，研发过程比较顺利，并没有遇到过很大的困难。从发现这一现象到完成几乎全部工作，大概历时1年半。遇到最大的困难应该是投稿过程过于漫长、充满了曲折。

4. 该项研究工作，在不远的将来会不会应用于临床治疗？其可能的优点和问题有些什么？

程强，魏妥：正如前面提到的，SORT技术的发现将会极大程度地促进LNPs的研发，非常有希望在不久的将来应用到临床治疗。最近生物研发公司ReCode利用此项技术完成A轮8000万美元的融资就是最好的见证。SORT的优点很突出，可以快速实现器官选择性RNA递送，从而扩大RNA治疗的应用范围。如，MC3 LNPs在2018年8月获美国FDA批准用于siRNA药物靶向肝脏的治疗，运用SORT技术可以快速精准的对MC3 LNPs进行改造，有可能加快siRNA或者mRNA在肺和脾脏中的应用；但是任何改造过的LNPs都属于全新的递送制剂，都需要从头到尾的的进行临床前研究，首要任务便是安全性评估，因此无法预测将会面临的问题。

5. 做研究的过程中，您有何经验和心得和大家分享？

程强，魏妥：我们认为对自己研究的课题感兴趣最为重要，内在的兴趣会督促你不断的思考和探索，但凡有一点突破就会高兴的不能自已，然后促使你进一步探索，形成好的良性循环。

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