时隔2个月，“器官特异性纳米颗粒” 再发Nature子刊！

蛙蛙

2020-06-29

第一作者：魏妥，程强

通讯作者：Prof. Daniel J. Siegwart

通讯单位：美国德克萨斯大学西南医学中心

CRISPR-Cas9作为一种强大的基因编辑工具，已被广泛应用于生物医学领域的各个方面。目前，递送CRISPR-Cas9 核酸酶系统主要有三种方式：质粒递送、Cas9mRNA/sgRNA共递送和Cas9/sgRNA核糖核蛋白 （RNPs）递送。由于低脱靶效应和低免疫原性的优势, RNPs递送越来越受到科学家们的青睐。然而RNPs具有分子量大、负电性强以及易失活等缺点，体内递送极具挑战。

奇物论曾报道过美国德克萨斯大学西南医学中心Daniel J. Siegwart教授课题组发表于Nature Nanotechnology的“器官选择性靶向（SORT）纳米颗粒”，在mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑的应用方面发挥巨大潜力。（深度解读，附专访）

近日，该课题组又乘胜追击，通过对传统脂质纳米颗粒（LNPs）的简单改造，成功解决了RNPs的体内递送难题，并高效介导了体内器官选择性的基因编辑（图1）。相关研究成果发表于Nature Communications上，题为“Systemic nanoparticle delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteinsfor effective tissue specific genome editing”。

图1 |脂质纳米颗粒5A2-DOT-X LNPs体内靶器官递送Cas9/sgRNA RNPs的策略。

研究亮点：

1.本文开发的脂质纳米颗粒5A2-DOT LNPs可实现Cas9/sgRNA RNPs的体内靶器官递送和高效基因编辑；

2.5A2-DOT LNPs可同时敲除多个基因位点，成功、快速地构建了器官特异性小鼠肿瘤模型；

3. 5A2-DOTLNPs可成功实现对小鼠疾病模型的基因编辑治疗，对遗传类疾病的治疗具有广泛的应用前景。

要点1: 5A2-DOT LNPs的开发过程

通常，LNPs包裹RNA的过程是在酸性缓冲液中完成。在酸性条件下，LNPs中的可电离阳离子脂质（ionizable cationic lipid）会带上正电荷，从而完成对负电荷RNA的包裹。与RNA不同，Cas9/sgRNA RNPs在酸性条件下极易失去活性，而在中性条件下更稳定。因此，研究人员必须尝试在中性缓冲液中包裹Cas9/sgRNA RNPs。可惜的是，可电离阳离子脂质在中性环境中并不会发生质子化，因此无法吸引带负电荷的Cas9/sgRNA RNPs。基于前期积累的经验，Daniel J. Siegwart教授课题组在LNPs原有的四种核心脂质的基础上引入了第五种阳离子脂质（DOTAP），这样不仅能增强其在中性条件下对Cas9/sgRNA RNPs的包载，而且保留了传统LNPs的高效递送能力。通过该策略，他们成功地将Cas9/sgRNA RNPs递送到细胞内，基因编辑效率高达80%以上。

要点2：5A2-DOT LNPs可实现对 RNPs的体内靶器官递送和高效基因编辑

    研究人员发现，将包裹Cas9/sgTOMRNPs的5A2-DOT-10 LNPs局部注射到tdTOM模型小鼠的肌肉和脑部，可成功实现对小鼠肌肉细胞和脑细胞的基因编辑，激活tdTomato基因并使之表达红色荧光。（图2a-e）

基于该课题组前期开发的Selective ORgan Targeting (SORT)技术，研究人员在原有四种脂质组分比例（5A2-SC8 :DOPE: Chol : PEG = 15:15:30:3）的基础上，通过调节DOTAP的摩尔比（5%-60%）制成了一系列包裹Cas9/sgTOM RNPs的5A2-DOT-X LNPs，并将其静脉注射到tdTOM模型小鼠和C57BL/6小鼠中。研究发现，随着DOTAP摩尔百分比的增加，基因编辑逐渐从小鼠肝脏转移到肺部，且肺部基因编辑效果更高。此外，研究人员还发现在低剂量下（0.33 mg kg⁻¹ sgRNA），5A2-DOT-50LNPs可高效递送多达6种sgRNA到小鼠肺部，并成功对针对的6个基因位点进行基因敲除。（图2f-j）

图2 | Cas9/sgRNA RNPs的体内靶器官递送和高效基因编辑。

要点3：5A2-DOT LNPs可快速构建器官特异性小鼠肿瘤模型

鉴于5A2-DOT LNPs可同时敲除多个基因位点，这对快速构建复杂的小鼠肿瘤模型具有极大的优势。因此，研究人员通过肝靶向纳米载体（5A2-DOT-5 LNPs）和肺靶向纳米载体（5A2-DOT-50 LNPs）分别递送多种不同的sgRNAs, 成功构建了小鼠肝癌模型和肺癌模型。该方法简单、快捷，为新型小鼠肿瘤模型的建立提供了新的思路。

图3 | 5A2-DOT LNPs可简化小鼠肝癌模型和肺癌模型的构建。

要点4：5A2-DOTLNPs可成功实现对小鼠遗传类疾病模型的基因编辑治疗

研究人员进一步探索了5A2-DOT LNPs对小鼠遗传类疾病模型的治疗潜力。通过与德克萨斯大学西南医学中心Eric N. Olson教授课题组合作，将包裹Cas9/sgDMD RNPs 的5A2-DOT-10 LNPs局部肌肉注射到杜氏肌营养不良症模型小鼠（ΔEx44 DMDmice）中，可成功对模型鼠肌肉细胞中的突变基因进行基因编辑和修复，并成功恢复了dystrophin蛋白在肌肉中的表达。（图4a-c）

接着，研究人员探索了肝靶向基因编辑的治疗潜力，以PCSK9为研究靶点。静脉注射5A2-DOT-5 Cas9/sgPCSK9 RNPs到小鼠体内后，成功在小鼠肝脏中检测到PCSK9位点的基因编辑，且使小鼠血清中PCSK9蛋白的表达水平显著降低。（图4d-f）

图4 | 5A2-DOT LNPs可成功实现对小鼠遗传类疾病模型的基因编辑治疗。

小结：

本文提供了一种器官选择性递送RNPs的有效策略。在传统脂质纳米颗粒组分的基础上引入一个永久性阳离子脂质，改进了包载RNPs的方法，使之能在中性缓冲液中进行，从而达到保护Cas9蛋白生物活性的目的。通过调节永久性阳离子脂质的加入比例，该文成功实现了RNPs的系统递送和器官选择性基因编辑。开发的RNPs递送体系不仅可以简化小鼠原位肿瘤模型的构建，还表现出了在遗传类疾病中基因治疗的应用价值。

参考文献及原文链接：

Wei,T., Cheng, Q., Min, Y. et al. Systemic nanoparticle delivery of CRISPR-Cas9ribonucleoproteins for effective tissue specific genome editing. Nat Commun 11,3232 (2020).

https://doi.org/10.1038/s41467-020-17029-3

通讯作者：

DanielJ. Siegwart是德克萨斯大学西南医学中心的副教授。他的研究计划专注于开发先进的基于聚合物和脂质的系统，该系统可精确控制大分子的结构、顺序和响应性，以用于药物输送、成像、遗传疾病和癌症。他是ReCode Therapeutics公司的共同创始人，致力于修饰tRNA负载的纳米颗粒，用于纠正引起囊性纤维化和其他疾病的无义突变。