两院院士活用透明质酸，全身注射型材料为出血性抢救争取黄金时间！

Natt

2020-08-04

几十年来，无法控制的出血一直是导致1至46岁人口死亡的主要原因，其中30至40％的死亡与平民和军人的重大失血有关。因为大多数死亡发生在外伤后的最初1小时内，所以出血控制对时间极为敏感，创伤护理的“黄金时间”概念就说明了这一点；在第1个小时内的止血干预将决定创伤患者的生存。但是，当前可用的现场干预措施（例如止血带和局部止血敷料）只能满足外部可及的和潜在可压缩的伤口的需要。近年来，组织内或腔内可注射、自膨胀的止血聚合物泡沫技术（如XSTAT和ResQFoam）和栓塞导管技术（如主动脉复苏性血管内球囊闭塞）的发展取得了一些进展，这样可以提高躯干出血控制的效率。

然而，对于内出血、弥漫性出血和非压迫性出血，除了少量止血药物外，输血（即充血的红细胞以及新鲜的冷冻血浆和血小板）和凝血因子浓缩液仍然是止血的主要临床治疗方法。尽管非常有效，但与生物产品的即时护理管理相关的一些挑战。

以血小板为例，其应用受到以下限制：（i）储存期限短（5至7天），存储要求严格；（ii）广泛的预筛选以避免免疫原性问题；以及（iii）高生物污染风险。即使在无菌的临床环境中，除创伤外，捐赠者血小板供应的短缺也增加了维持血小板库存以治疗手术相关性出血，肿瘤性凝血障碍以及化学/放射疗法引起的骨髓抑制的出血并发症的挑战。因此，迫切需要开发可以克服上述挑战并促进在难以接近的损伤部位快速形成血凝块的静脉止血剂。

成果简介：

聚合物结构由于其高水溶性、柔韧性和在分子水平上对其靶部分的多价亲和力，为治疗提供了一个诱人的平台。以透明质酸（HA）为模型聚合物主链，美国工程院、医学院双院院士、哈佛大学教授Samir Mitragotri等人报道了一种止血剂，将HA与VBP（TRYLRIHPQSQVHQI）和CBP（[GPO]₇H）结合，并通过聚合物肽融合（HAPPI），实现高效、无全身毒性的止血效果。CBP介导HAPPI与血管损伤部位暴露的胶原的结合，而VBP是因子VIII蛋白的短序列，负责与vWF结合，VBP介导HAPPI与固定在活化血小板上的vWF结合，并在损伤部位破坏内皮。相关成果发表在Science Advances 上

图|血管损伤后HAPPI止血机制的图示

作为细胞外基质和内皮糖萼的关键成分之一，HA为设计大分子疗法提供了极好的框架。从合成的角度来看，由于HA在其主链上存在多个官能团，因此它提供了一个出色的构建基块。根据此原理，使用EDC/磺基-NHS介导的偶联反应将CBP和VBP与HA偶联。HA的羧酸基团首先被EDC和磺基-NHS活化，并进一步与肽的伯胺反应，得到HA-CBP-VBP缀合物，即HAPPI。肽的取向因此被采用，因为肽的C末端朝外并且N末端朝HA主链。荧光染料[AF 647]也与HA骨架偶联，以促进体内生物分布和药代动力学研究。

图|AF647标记的HA-CBP-VBP共轭物（HAPPI）的合成与表征

失血减少97％

接下来在体内研究了HAPPI在小鼠尾静脉切开（割破）模型中的止血能力，该模型是确定止血能力的公认模型。与未治疗组相比，HA-VBP和HAPPI显着降低了出血时间和出血量。使用HAPPI可使出血时间减少约99％，失血减少97％。

图|HA肽结合物在小鼠尾部割伤模型中的止血作用

在受伤的小鼠中确定了HAPPI的药代动力学和生物分布。发现HAPPI的循环半衰期与天然HA在约1小时的半衰期几乎相同。为了评估CBP和VBP在观察到的结合物生物分布中的作用，测量了HA的生物分布。总体而言，两者之间的差异不大。在这两种情况下，肝脏和脾脏中的积累都是可比的。HAPPI在损伤部位的积累与天然HA的积累无统计学差异。在30分钟，1天和7天的治疗后的组织病理学分析在任何一个治疗组中均未显示任何炎症或毒性。在任何重要器官中均未发现微血栓。

图|BALB/c小鼠中HAPPI的动力学，生物分布和组织学分析

只与活化的血小板结合

为了了解HAPPI止血功效改善的机制，研究人员首先通过荧光活化细胞分选法（FACS）研究了HAPPI与鼠血小板之间的相互作用。HA和HAPPI均未诱导血小板的显著活化。然而，与各个对照相比，HAPPI显示出与活化的血小板的结合增加。也就是说，HA本身不表现出对活化或未活化血小板的结合。但是，与未活化的血小板相比，HAPPI与活化的血小板的结合性高5.4倍。这可能归因于vWF在ADP活化的血小板表面上的结合。

图|HAPPI与血小板的相互作用及其良好的结合能力

协同作用才有效

在血小板减少性小鼠中评估HAPPI和天然血小板之间的协同作用，注射HAPPI组的出血时间有所减少。仔细检查发现，注入缀合物后出血几乎停止了〜4分钟。但是，此后出血重新开始。这些结果表明，尽管HAPPI本身并不能形成坚固的物理栓塞来止血，但它们与天然血小板的结合非常有效。

延长黄金时间

在了解HAPPI止血功效的基础上，研究人员进一步评估了其在下腔静脉穿刺（IVC）引起的致死性创伤性出血模型中改善止血和存活率的能力。在该模型中，将HAPPI的疗效评估为一种抢救治疗策略，其中在IVC出血发作时进行HAPPI输注。用HAPPI治疗的大鼠的生存时间明显更长。平均生存时间从25分钟增加到71分钟。这一结果具有临床意义，因为为防止院前死亡，迫切需要能够在这种不可压缩的创伤性出血后延长生存期超过黄金时段的疗法。

图|HAPPI对两种模型小鼠的止血作用

总结与展望

总的来说，HAPPI作为速效静脉止血药具有极好的前景。在两种动物模型中验证了其止血功效。在小鼠尾静脉割破模型中，通过注射HAPPI可使失血量显着减少（> 97％），突显了HA聚合物上多价呈递肽的卓越止血功效。在由IVC破裂所致的大鼠致死性致命性出血模型中，HAPPI可以将生存时间大幅延长至71分钟。这些聚合剂的简便合成和长期在环境中的储存稳定性为即时医疗提供了优于血液或其他生物止血剂的优势。

尽管HAPPI在两种不同的出血模型中显示出止血功效，但该研究的几个方面仍需进一步探索。如：

1）HAPPI与活化的血小板的结合的确切的分子结合机制仍不清楚。

2）在小鼠尾静脉割破出血模型中，盐水处理组的出血时间和失血减少了，这种现象的原因需要进一步调查。

3)在大鼠IVC创伤模型中，HAPPI延长了生存时间，但并未如预期的那样减少失血，这可能归因于损伤后即刻快速出血和失血性休克。

4)此外，HAPPI的止血功效应在大型动物（如猪）的出血性出血模型中进行验证，并应具有完整的生命体征/尿排量和动脉血气监测。

5)对天然血小板的依赖可能会限制其在血小板减少症或血小板功能障碍患者或接受抗血小板药物治疗的患者中的应用。

由于HAPPI具有易于合成的连接多个部分以增加功能的合成便利性，因此可以与其他疗法组合进一步应用于止血。作为一种通用的药物输送平台，聚合物偶联物提供了许多自由度，可以包含其他药物分子用于其他血管疾病（例如中风和动脉粥样硬化）的诊断或治疗作用。

参考文献：

Yongsheng Gao, et al., A polymer-based systemic hemostatic agent. Science Advances 2020.

DOI:10.1126/sciadv.aba0588

https://advances.sciencemag.org/content/6/31/eaba0588