半年又发Nature Materials，直接调节剂量即可提高肿瘤递送效率！

NanoLabs

2020-08-13

将纳米颗粒递送到实体瘤中对于其在诊断和治疗癌症中的实用性至关重要。最近发现，只有0.7％（中位数）的纳米颗粒被成功递送到实体瘤中，这一低值导致了纳米药物的临床转化之路困难重重。该研究的结果激励了许多研究人员探索不同的途径来提高纳米颗粒的输送效率。这些包括改变纳米粒子的物理化学性质，例如大小、形状和表面化学，或使用生物技术，例如消融或饱和库普弗细胞。尽管有所增加，但挑战在于，这些方法均未提出提高递送效率的中心系统性原则。鉴于递送已经成为纳米技术和许多新兴技术（例如基因组编辑和免疫疗法）中的主要问题，有必要制定提高纳米颗粒到靶点的传递效率的通用原则。这些原则可以通过重新评估以前的基础研究或设计策略来发展，以克服阻碍纳米颗粒向肿瘤传递的障碍。解决这一递送问题对于纳米技术的治疗和转化至关重要。

鉴于此，加拿大多伦多大学Warren C. W. Chan等人发现给药剂量的阈值是解决递送效率低的关键，想要实现可预测和显著的释放，则必须打破这个剂量阈值。相关成果以题为“The dose threshold for nanoparticle tumour delivery”，于8月10日发表在Nature Materials上。

肝清除的剂量阈值

研究人员通过评估纳米颗粒剂量与肝脏清除率之间的关系来开始研究。肝脏是最大的网状内皮系统（RES）器官，并且占所施用纳米颗粒的很大一部分。假设一旦剂量超过最大Kupffer细胞摄取率，肝脏对纳米颗粒的摄取比例将显着降低。本研究的目标是找到可以降低肝脏清除率的阈值剂量。

在4T1荷瘤BALB/c小鼠中，通过静脉注射注入不同数量的50 nm PEG化金纳米颗粒，从500亿到50万亿纳米颗粒，跨越了1000倍。选择金纳米颗粒是因为它们是惰性的，并且可以在很宽的剂量范围内以高灵敏度检测到。使用ICP-MS量化了组织中金的生物分布，观察到，随着剂量的增加，肝脏积累的注射纳米颗粒的比例下降。这对应于纳米颗粒血液半衰期从2分钟到8小时的增加。这表明在高剂量下PEG化纳米颗粒的肝脏清除效率受到限制。

研究人员探索了潜在的剂量阈值。他们研究了肝细胞在24h内可能摄取的纳米颗粒数量，肝巨噬细胞内在化的纳米颗粒数量最多，因此假设这些巨噬细胞被充盈了。首先，在体外，这些细胞在24 h内每个细胞累积约100,000个纳米颗粒。在体内，小鼠的库普弗细胞数量约为1000万个，因此估计，在24小时内，小鼠肝脏中所有库普弗细胞的总清除率极限约为1万亿个纳米颗粒。并观察到，随着剂量增加超过1万亿个纳米颗粒的阈值单剂量，库普弗细胞吸收的纳米颗粒数量成比例减少。而且超过之后，肝细胞便会充当肝脏蓄积库。该研究结果表明，在24h内，单次剂量超过1万亿纳米颗粒时，库普弗细胞的摄取量基本上受到限制。

图1. 肝清除率阈值

库普弗细胞中剂量阈值的机制

研究人员没有观察到库普弗细胞的总摄取能力达到饱和，所以假设高剂量反而压倒了摄取率。用活体显微镜测量注射后30分钟内库普弗细胞的实时纳米粒摄取率。当更多的粒子竞争摄取时，高剂量抑制了摄取率，但是实际上巨噬细胞并未达到饱和。这些结果证明，超过阈值的大量纳米颗粒通过压倒了库普弗细胞的摄取速率而不是摄取能力，从而压倒了肝脏清除率。

通过研究细胞摄取途径，表明纳米颗粒的剂量阈值与库普弗细胞上可用受体的数量和结合位点有关。但是具体的受体仍有待确定。超出此可用结合位点阈值的剂量会使库普弗细胞的吸收速率被压倒，肝脏清除率降低，血液循环延长。

图2. 剂量阈值由摄取率决定

单剂量大量给药才有效

还研究了作为纳米颗粒数函数的肿瘤递送，以评估剂量阈值并表征超过该阈值的递送。在体内实验中证实，随着纳米颗粒数量的增加，肿瘤的递送增加，肝脏的积累相应减少。大约1万亿个纳米颗粒标志着这两个器官非线性剂量依赖性的开始的拐点。

这支持了上面的结果和理论，即最小阈值剂量将开始使肝脏的清除能力压倒，并增加肿瘤的递送。还比较了单剂量和分开多次的生物分布，以测试这种作用是否是累积的。情况并非如此，因为尽管两组中纳米粒子的总数相同，但大剂量单剂量显示出肝脏堆积减少，循环半衰期延长和肿瘤递送增加。这些结果证实了单次注射超过1万亿个纳米颗粒的阈值可以改善肿瘤的递送。而且还表明，对于各种纳米颗粒的大小、组成和肿瘤模型，超过1万亿个纳米颗粒的剂量都会显着增加了肿瘤的递送。

图3. 肿瘤递送的剂量阈值

增强渗透！

研究还研究了增加剂量和递送对纳米粒子与肿瘤细胞相互作用的影响。使用三维CLARITY成像对血管附近的纳米粒子进行了成像，并观察到超过一万亿阈值的更高剂量的纳米粒子从血管分布得更深，更深地分布在肿瘤组织中。高剂量分布在整个肿瘤细胞中，大部分分布在细胞内。流式细胞仪定量分析显示93％的活细胞以高剂量摄取了纳米颗粒。这些结果表明，施用数量超过阈值的纳米颗粒增强了纳米颗粒肿瘤的渗透并改善了向肿瘤细胞群体的递送。

图4. 超过阈值的肿瘤渗透和细胞递送

直接改善治疗效果

使用细胞毒性纳米颗粒Caelyx/Doxil测试了我们纳米颗粒剂量理论。为了消除纳米颗粒剂量对药物剂量的影响，选择使用良性填充剂纳米颗粒人为地增加纳米颗粒剂量，以增加纳米颗粒剂量而不增加细胞毒性药物，以增加肿瘤的传递。通过体内研究并于RES阻断技术进行比较，结果表明剂量阈值原理比RES阻断技术更有效。总体而言，实验结果证明，给予超过阈值的纳米颗粒剂量可直接改善治疗效果，而与活性药物剂量无关。

图5. 高于阈值的Caelyx治疗功效

之前文献中都存在1万亿的阈值

研究人员对2016年的那组荟萃分析论文进行了重新分析，以调查该阈值是否在其他研究中存在。分析表明，纳米粒子的数量对肿瘤的传递比大小，靶向设计，纳米粒子类型或癌症模型贡献更大。弹在这些论文中，以纳米粒子数量表示剂量的重要性显然是未知的，因为一半的研究使用的纳米粒子剂量高于万亿阈值，而一半的使用低于万亿阈值，这表明剂量是任意选择的。这些结果强调，纳米粒子的剂量数量与肿瘤递送之间的关系是显著的，但迄今为止尚未实现。研究人员敦促之后的研究可考虑以高于阈值的剂量施用纳米颗粒。

图6. 确定2005-2015年文献中的剂量阈值

转化潜力

通过探索将该阈值概念转化为人类患者的潜力。分析小鼠和人类之间的给药转化，发现在小鼠中发现阈值也可能适用于人类。并估计人纳米颗粒制剂的给药剂量应超过1,500万亿纳米颗粒的阈值，以实现有意义的肿瘤递送。成功的临床纳米颗粒（例如Caelyx，Myocet和Onivyde）的典型剂量分别超过了该阈值，分别为8.6、1.7和1.9万亿纳米颗粒。因此，未来的研究应研究使用纳米颗粒数作为剂量对临床纳米药物疗效的度量的作用。

小结

发现了可改善纳米颗粒递送和治疗的纳米颗粒数量阈值剂量。在这里，我们观察到1万亿个纳米颗粒的一般阈值可最大程度地将其递送至肿瘤，达到小鼠注射剂量的12％。该特定值在纳米颗粒设计和体内物种之间可能有所不同，但它为大于10纳米的纳米颗粒的纳米颗粒递送形成了基本剂量阈值概念。未来的研究应研究不同的纳米颗粒设计如何改善该阈值并调节其传递范围，哪些库普弗细胞受体变得不堪重负，哪些生物肿瘤机制在高剂量下起主导作用以增加肿瘤进入。为了立即进行转化，当前临床上批准的抗癌纳米颗粒制剂（例如Caelyx /Doxil）可以采用递送增强剂策略来改善递送和针对实体瘤的治疗功效。设想相对于该阈值对纳米粒子剂量进行广泛而仔细的评估将提供一种强大，通用和简单的方法来推进新一代成像，诊断和治疗的递送策略。

参考文献：

1. Ouyang,B., et al. The dose threshold for nanoparticle tumourdelivery. Nat. Mater. (2020).

https://doi.org/10.1038/s41563-020-0755-z