注意！氧化石墨烯进入血液，或致动物过敏性死亡，樊春海院士/诸颖研究员最新研究再次关注纳米材料安全！

NanoLabs

2020-09-09

在2019年，ChemSec将碳纳米管添加到SIN列表中，原因是它们具有致癌性、持久性并且可能对生殖有害。至此，CNT成为此列表中的首个纳米材料。

今年2月，奇物论针对发表在Nature Nanotechnology的报道进行相关探讨，详见：关注丨由于致癌风险，碳纳米管被列入国际危险品清单，成为清单中的首个纳米材料！

近日，国际顶级期刊Nano Today发表了樊春海院士、诸颖研究员等人的一项关于氧化石墨烯（GO）的毒理学研究，表明GO的血液暴露可能导致过敏性死亡。

以下为具体论文研究表述：

氧化石墨烯（GO）及其衍生物是新兴的一类碳纳米材料（CNM）。由于其独特的二维（2D）结构，GO具有出色的功能，例如超高表面积，使其成为一种极具吸引力的工业应用材料。GO在光学/电子电路、能量产生和存储等工业应用中的不断增加的生产和使用，这增加了人类接触GO的机会。同时，最近的研究也致力于生物医学应用，包括癌症诊断、药物输送和免疫治疗。但是，这些研究通常还停留在基础研究阶段，临床转化有限。一个主要障碍是体内使用GO的安全问题。因此，迫切需要评估GO对人类健康的影响。

已经对GO的毒理学进行了广泛的研究，主要是在体外细胞和小模型动物的水平上。但是，在不同剂量的不同水平模型上的研究中，结论常常差异很大，甚至彼此矛盾。例如，小鼠在体外培养的细胞和斑马鱼中经常观察到的CNMs诱导的氧化应激。此外，在动物物种中，对相同材料的免疫反应也不同。尤其是，GO对人类的潜在影响仍待探索。由于非人类灵长类动物与人类的密切遗传和生理关系，它们可能提供有价值的信息。但是，目前尚无非人类灵长类动物中GO的毒理学资料。

成果简介：

鉴于此，上海交通大学樊春海院士、中科院上海高等研究院诸颖研究员等人研究了在最大安全起始剂量下，血液暴露于GOs对BALB/c小鼠和非人灵长类动物（食蟹猕猴）的影响。研究表明GO的血液暴露可能诱导非人灵长类动物的过敏性死亡，成果发表于Nano Today上。

实验设计如图1所示，由以下部分组成：

（1）每个CNM的血液循环，

（2）在不同时间点进行血液、生物医学标记和尿液常规分析，

（3）给药后90 d的主要器官组织病理学评估，

（4）给药后90 d的微量元素生物分布观察，

（5）注射后每周监测温度和压力。

（6）注射后每周监测体重。

图|材料和实验设计

安全剂量取决于其尺寸和形状

该研究使用的为PEG化GO，其尺寸范围为20-80nm。Zeta电位为轻微的负电荷。体外细胞毒性实验显示：GO最高安全剂量约51 μg/mL，NDs为52μg/mL，而SWCNT呈现出更低的最大安全剂量（1.5 μg/mL）。这些结果表明，CNMs的安全剂量取决于其尺寸和形状。

剂量转换

在动物实验中，根据需要，通过静脉内输注（2mL/min），向各组猴子施用在0.9％氯化钠中的CNM分散体。根据美国FDA指南，注射剂量按照以下以下公式进行转换：

计算得出，GO对猕猴的最大推荐起始剂量（MRSD）为4 mg/kg。SWCNTs和NDs的MRSD分别为4 mg/kg和0.12mg/kg。

快速致死

研究结果很令人惊讶，在121只接受治疗的小鼠中，有7只在GO暴露后1-12小时死亡（死亡率为5.8％）。还观察到至少有一只老鼠在死亡之前经历了呕血。至于猕猴，5只猴子中有1只在GO暴露后约1.5小时内死亡的（死亡率为20％）。在死之前，这只猴子蹲在地上，表情很痛苦（看似胸痛），伴有呕血。相比之下，分别在其MRSD下进行ND或SWCNT给药的却没有引起动物的任何呕血或死亡。

发生急性肝和心脏损伤

为了找出死亡原因，研究人员首先在接受GO治疗的动物中进行了时间点的血液检查。检查指标包括2个肝功能指标和2个心脏指标。

观察到20只小鼠中有5只（25％）的指标水平异常，与对照组的平均水平相比，这些小鼠的这些指标上升了约3-20倍。特别是，CK水平显示出快速升高（暴露后第1小时升高4倍）。这些异常指标表明在这些动物中发生了急性和严重的肝和心脏损伤。至于死去的猴子，与对照组相比，其AST，ALT，CK和LDH的水平也分别上升了约8倍，20倍，10倍和21倍。

过敏反应致死

上面结果表明在这些GO治疗的动物中可能存在过敏反应（或超敏反应）。过敏反应是一种通过接触致敏生物体中的特定抗原而引发的严重的，威胁生命的超敏反应（HSR）。它通常在暴露后几分钟到几小时内发生，且与某些肝/心脏指标突然升高有关。值得注意的是，在小鼠中，具有异常指标的发生率（25%）远高于死亡率（5.8%），表明小鼠可能遭受这种异常情况但存活下来。此外，来自所有存活的GO处理的猴子的指标在正常范围内，表明与等效剂量下的小鼠相比，猴子对GO诱导的过敏反应的耐受性较低。

然后，研究人员检测了下过敏反应的相关指标（IgE和IL-4），2.8％存活的小鼠在暴露于GO后，IgE水平升高至180倍以上。数据证实了GO在哺乳动物中诱导IgE介导的过敏反应。

图|GO诱发鼠类和非人类灵长类动物的过敏反应

循环时间长惹的祸？

接下来，研究人员研究了动物体内GO的血液循环。GOs的平均血浆半衰期无论在小鼠体内还是在猴子体内均比NDs和SWCNTs的要长，在猴子中，GOs的血浆半衰期约为40 h，而NDs和SWCNT的分别为79 min和4 h。这些结果表明GO触发的过敏反应可能是由于GO的血液循环时间长引起的。

过敏反应致肺充血

对死亡的小鼠和猴子进行解剖检查，在组织学图像中，发现肺实质对肺泡呈现严重的结构损伤。大量红细胞渗入肺泡腔，表明弥漫性肺泡出血。还观察到黑色GO颗粒状在肺实质中。而心脏，肝脏，脾脏，肾脏和淋巴液样本则无明显变化。因此，推测GO在血液中的长循环可能导致其远端滞留和沉积在肺组织中，这可能在那里引起过敏反应，导致致命的肺充血。

图|GO引起的跨物种过敏反应分析

个体间差异

但是，除了GO引发的过敏反应外，包括GO在内的所有三个CNMs对于动物的不良影响均很小，主要器官的病理变化也很小，且没有观察到小鼠或猴子的行为异常。值得注意的是，在某些时间点，暴露于GO或SWCNTs的小鼠或猴子的肺或脾脏中似乎有少量黑色颗粒状沉淀，表明这两种CNMs可以在身体组织中保留数天甚至几周。然而，CNM沉积不一定诱导过敏反应。相比之下，发现NDs可以在一星期内在小鼠中所有器官中清除，这表明NDs引发过敏反应的风险较小。

图|鼠类和非人类灵长类动物中三种CNM的生物相容性评估

讨论与总结

众所周知，纳米材料的生物学性质高度依赖于它们的结构参数和表面化学/物理性质。如该研究使用的2D、1D、0D碳纳米材料产生的结果也不一样，2D GO材料的血液暴露可能在小鼠和非人灵长类动物中诱导过敏反应。鉴于制备过程很难控制精确的尺寸和形状，因此毒理学研究CNMs的结论经常不一样或相互矛盾，这现象也是合理的。

还值得注意一点就是，不同的物种和个体间存在差异性，简单转换来自其他物种的等效GO剂量不能确保人类的安全。而非人灵长类动物，则可以重现人类患者的临床症状，因此适用于临床前安全性研究，这表明纳米材料在高等哺乳动物中的体内应用应该受到更多关注。特别是，在GO和GO衍生物的人体试验之前，需要单独的过敏试验和筛选过敏反应拮抗剂作为辅助手段。

综上所述，本文证明在MRSD下GO的血液暴露可能诱导非人灵长类动物的过敏性死亡。尽管GO在大多数小鼠或猴子中没有显示出急性或长期的不良反应，但GO引起的不可忽视的过敏反应甚至死亡引起了对其体内安全性的担忧。因此，这项研究表明，在生物医学使用纳米材料之前，逐一的过敏测试是必不可少的。

参考文献：

YunfengLin, et al.,Blood exposure to graphene oxide maycause anaphylactic death in non-human primates. Nano Today 2020.

https://doi.org/10.1016/j.nantod.2020.100922