诺奖技不如人？Science：简单操作迎来革命性突破，让冷冻电镜更快、更好、更便宜！

小纳米

2020-10-15

2017年，诺贝尔化学奖授予Jacques Dubochet, Joachim Frank和Richard Henderson三位科学家，以表彰他们在冷冻电镜领域的贡献。冷冻电镜使得高分辨率观测蛋白质等活性生物大分子结构成为可能，为结构生物学迎来了一个崭新的时代。

冷冻电镜的发展已有数十年历史，它通过在电子样品上发射电子并记录所得图像来确定其形状。探测反弹电子的技术和图像分析软件的进步催生了一场始于2013年左右的“分辨率革命”。

尤其是2017年获得诺贝热奖以来，冷冻电镜一直在寻找突破，以实现更高的分辨率。

不断突破

2019年12月26日，颜宁教授团队简单改变了石墨烯grids的制备方法，帮助冷冻电镜上了一个新台阶。他们采用一种简单的策略，可制备出单层石墨烯覆盖率高达99％的冷冻电镜专用网格，超过70％的网格可用于采集有效数据，从11000个颗粒中，研究团队以目前最小的蛋白质为例，获得了超高分辨率：2.6 Å（也就是0.26 nm）。

图1. 石墨烯网格用于冷冻电镜

Yimo Han, Nieng Yan et al. High-yield monolayer graphene grids fornear-atomic resolution cryoelectron microscopy. PNAS 2019.

https://www.pnas.org/content/early/2019/12/24/1919114117

2020年5月22日，来自德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所的生物化学家和电子显微镜学家Holger Stark团队，和英国剑桥分子生物学医学研究委员会实验室(MRC-LMB)的结构生物学家Sjors Scheres和Radu Aricescu领导的团队分别在bioRxiv预印本同时发表文章，报道了一项革命性的突破：分辨率达到1.25 Å，第一次看见蛋白质中的单个原子。

图2. 蛋白质Apoferritin的冷冻电镜图

尽管冷冻电镜的分辨率在不断提高，甚至达到了单原子尺度的分辨率，但是，挑战依然存在！

关键问题在于：由于电子束损坏和样品移动模糊而造成的最高分辨率信息丢失，必须平均数以万计的图像以补偿信号损失。

时代的呼唤

2019年底以来，新型冠状病毒病（COVID-19）的全球大流行，将冷冻电镜的优缺点进一步凸显出来。

结构生物学促进了对SARS-CoV-2的理解，自2020年3月初以来，已有330多个结构存放于蛋白质数据库中。截止目前，数据库中的264个结构是通过X射线晶体学生成的，72个是通过冷冻电镜生成的。

X射线晶体学技术，一天之内就收集了约1500个数据集，而冷冻电镜24小时才能收集1个数据量。冷冻电镜不仅通量小，而且价格贵，维护成本高。这些优势使X射线晶体学更适合于药物研发和科学研究。

拿了诺奖，却还是有点“技不如人”，不得不说，确实有点小尴尬！

新的里程碑

为了增加冷冻电镜处理数据的通量，并极大地降低成本以加速科学研究发现，MRC分子生物学实验室Christopher J. Russo等人报道了一种全新的支撑膜，不仅可以提高图像质量和收集效率，而且成本大幅降低。

图3. HexAuFoil

核心设计：

传统的冷冻电镜技术，通常是将蛋白质嵌入直径约1-2 μm的孔的支撑膜上的玻璃化冰层中进行拍摄。研究人员发明了一种称之为“HexAuFoil”的冷冻电镜支撑膜，与传统支撑膜相比，HexAuFoil的核心设计在于：

1）使这些孔变小（直径为200至300 nm），并将它们更紧密地堆积在一起，这样极大地提高了数据通量。每次载物台移动可获取200张图像，使用适当配置的显微镜，甚至可以获取多达800张图像。

2）通过最大程度地减少辐射损坏和样品移动造成的信息损失，来提高数据质量。分析表明，成像过程中样品运动的主要原因是玻璃化冰层的弯曲。于是，研究人员根据孔径，设计了具有最佳基材厚度的支撑膜，从而将样品在曝光过程中的总运动幅度降低至<1 Å。这样，研究人员可以在样品被辐射损坏之前，用数学方法将数据构建成到三维地图。

关键创新点：

1）这项技术，让冷冻电镜的原子级分辨率更加普适，可以应用于更多不稳定的蛋白质。

正如上文提到，德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所的生物化学家和电子显微镜学家Holger Stark团队，和英国剑桥分子生物学医学研究委员会实验室(MRC-LMB)的结构生物学家Sjors Scheres和Radu Aricescu使用标准支撑膜，第一次真正实现了原子级冷冻电镜重建，但是他们所使用的是一种稳定的蛋白质：脱铁铁蛋白。

2）更快的数据搜集和更低的成本

使用软件校正光束，可以调控运动对图片质量和分辨率的影响，但是无法提供更高的数据处理通量。

未来可期

通过一种简单的网格支撑膜的设计，使更多科研人员能够享受到冷冻电镜带来了的便利，以实现更快地获取更高质量的图像，这项技术不可谓不令人神往。

我们相信，冷冻电镜的真正潜力尚未爆发。

参考文献：

1. Katerina Naydenova et al. Cryo-EM with sub–1 Å specimen movement. Science 2020, 370, 223-226.

https://science.sciencemag.org/content/370/6513/223

2. Micah Rapp et al. Better, faster, and even cheap. Science 2020, 370, 171.

https://science.sciencemag.org/content/370/6513/171