诺奖技不如人?Science:简单操作迎来革命性突破,让冷冻电镜更快、更好、更便宜!

2017年,诺贝尔化学奖授予Jacques Dubochet, Joachim Frank和Richard Henderson三位科学家,以表彰他们在冷冻电镜领域的贡献。冷冻电镜使得高分辨率观测蛋白质等活性生物大分子结构成为可能,为结构生物学迎来了一个崭新的时代。
冷冻电镜的发展已有数十年历史,它通过在电子样品上发射电子并记录所得图像来确定其形状。探测反弹电子的技术和图像分析软件的进步催生了一场始于2013年左右的“分辨率革命”。
尤其是2017年获得诺贝热奖以来,冷冻电镜一直在寻找突破,以实现更高的分辨率。
不断突破
2019年12月26日,颜宁教授团队简单改变了石墨烯grids的制备方法,帮助冷冻电镜上了一个新台阶。他们采用一种简单的策略,可制备出单层石墨烯覆盖率高达99%的冷冻电镜专用网格,超过70%的网格可用于采集有效数据,从11000个颗粒中,研究团队以目前最小的蛋白质为例,获得了超高分辨率:2.6 Å(也就是0.26 nm)。
图1. 石墨烯网格用于冷冻电镜
Yimo Han, Nieng Yan et al. High-yield monolayer graphene grids fornear-atomic resolution cryoelectron microscopy. PNAS 2019.
https://www.pnas.org/content/early/2019/12/24/1919114117
2020年5月22日,来自德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所的生物化学家和电子显微镜学家Holger Stark团队,和英国剑桥分子生物学医学研究委员会实验室(MRC-LMB)的结构生物学家Sjors Scheres和Radu Aricescu领导的团队分别在bioRxiv预印本同时发表文章,报道了一项革命性的突破:分辨率达到1.25 Å,第一次看见蛋白质中的单个原子。
图2. 蛋白质Apoferritin的冷冻电镜图
尽管冷冻电镜的分辨率在不断提高,甚至达到了单原子尺度的分辨率,但是,挑战依然存在!
关键问题在于:由于电子束损坏和样品移动模糊而造成的最高分辨率信息丢失,必须平均数以万计的图像以补偿信号损失。
时代的呼唤
2019年底以来,新型冠状病毒病(COVID-19)的全球大流行,将冷冻电镜的优缺点进一步凸显出来。
结构生物学促进了对SARS-CoV-2的理解,自2020年3月初以来,已有330多个结构存放于蛋白质数据库中。截止目前,数据库中的264个结构是通过X射线晶体学生成的,72个是通过冷冻电镜生成的。
X射线晶体学技术,一天之内就收集了约1500个数据集,而冷冻电镜24小时才能收集1个数据量。冷冻电镜不仅通量小,而且价格贵,维护成本高。这些优势使X射线晶体学更适合于药物研发和科学研究。
拿了诺奖,却还是有点“技不如人”,不得不说,确实有点小尴尬!
新的里程碑
为了增加冷冻电镜处理数据的通量,并极大地降低成本以加速科学研究发现,MRC分子生物学实验室Christopher J. Russo等人报道了一种全新的支撑膜,不仅可以提高图像质量和收集效率,而且成本大幅降低。
图3. HexAuFoil
核心设计:
传统的冷冻电镜技术,通常是将蛋白质嵌入直径约1-2 μm的孔的支撑膜上的玻璃化冰层中进行拍摄。研究人员发明了一种称之为“HexAuFoil”的冷冻电镜支撑膜,与传统支撑膜相比,HexAuFoil的核心设计在于:
1)使这些孔变小(直径为200至300 nm),并将它们更紧密地堆积在一起,这样极大地提高了数据通量。每次载物台移动可获取200张图像,使用适当配置的显微镜,甚至可以获取多达800张图像。
2)通过最大程度地减少辐射损坏和样品移动造成的信息损失,来提高数据质量。分析表明,成像过程中样品运动的主要原因是玻璃化冰层的弯曲。于是,研究人员根据孔径,设计了具有最佳基材厚度的支撑膜,从而将样品在曝光过程中的总运动幅度降低至<1 Å。这样,研究人员可以在样品被辐射损坏之前,用数学方法将数据构建成到三维地图。
关键创新点:
1)这项技术,让冷冻电镜的原子级分辨率更加普适,可以应用于更多不稳定的蛋白质。
正如上文提到,德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所的生物化学家和电子显微镜学家Holger Stark团队,和英国剑桥分子生物学医学研究委员会实验室(MRC-LMB)的结构生物学家Sjors Scheres和Radu Aricescu使用标准支撑膜,第一次真正实现了原子级冷冻电镜重建,但是他们所使用的是一种稳定的蛋白质:脱铁铁蛋白。
2)更快的数据搜集和更低的成本
使用软件校正光束,可以调控运动对图片质量和分辨率的影响,但是无法提供更高的数据处理通量。
未来可期
通过一种简单的网格支撑膜的设计,使更多科研人员能够享受到冷冻电镜带来了的便利,以实现更快地获取更高质量的图像,这项技术不可谓不令人神往。
我们相信,冷冻电镜的真正潜力尚未爆发。
参考文献:
1. Katerina Naydenova et al. Cryo-EM with sub–1 Å specimen movement. Science 2020, 370, 223-226.
https://science.sciencemag.org/content/370/6513/223
2. Micah Rapp et al. Better, faster, and even cheap. Science 2020, 370, 171.
https://science.sciencemag.org/content/370/6513/171
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