称霸天下？第一次，冷冻电镜看见单个原子！
纳米技术
2020-10-27
撰文丨纳米技术
校审丨未央
2017年，诺贝尔化学奖授予Jacques Dubochet, Joachim Frank和Richard Henderson三位科学家，以表彰他们在冷冻电镜领域的贡献。冷冻电镜使得高分辨率观测蛋白质等活性生物大分子结构成为可能，为结构生物学迎来了一个崭新的时代。
20世纪70年代以来，冷冻电镜的发展已有数十年历史，它通过在电子样品上发射电子并记录所得图像来确定其形状。这使得蛋白质结构比以往任何时候都更清晰，几乎与X射线晶体学获得的结构一样好，X射线晶体学是一种更古老的技术，当蛋白质晶体受到X射线轰击时，它会从蛋白质晶体的衍射图案中推断出结构。
2013年以来，冷冻电镜一直在寻找突破，以摆脱X-射线晶体学，成为结构生物学领域的绝对霸主。但是，它还存在一个关键问题悬而未决：分辨率不够高！
2020年5月22日，来自德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所的生物化学家和电子显微镜学家Holger Stark团队，和英国剑桥分子生物学医学研究委员会实验室(MRC-LMB)的结构生物学家Sjors Scheres和Radu Aricescu领导的团队，分别在bioRxiv预印本同时发表文章，报道了一项激动人心的结果。2020年10月22日，这两个课题组在Nature背靠背发表论文，正式向全世界宣告了这一革命性的突破：第一次看见蛋白质中的单个原子。蛋白分子的三维精确原子结构解析对生物学领域中生理过程机理研究至关重要，对原子结构、配位环境更加精确的理解能够对蛋白功能作用过程和机制进一步理解。随着硬件和软件进步，虽然冷冻电镜结构分辨率得到进一步提高，但是仍然难以在较高的分辨率中对每个原子成像。因此，科学家们在很大程度上还是要依赖于X射线晶体学来获得原子分辨率的结构。这就产生了一个关键问题：研究人员可能要花费数月至数年的时间才能使蛋白质结晶，此外，许多医学上重要的蛋白质也无法形成有用的晶体。相比之下，冷冻电子显微镜只需要蛋白质在纯化溶液中即可。原子分辨率图的精确度足以精确识别蛋白质中单个原子的位置，分辨率约为1.2 Å（1.2´10-10 m）。这些结构对于了解酶的作用方式以及利用这些见解来识别可阻断其活性的药物特别有用。为了推动冷冻电镜达到原子分辨率，两个团队致力于一种名为脱铁铁蛋白（apoferritin）的储铁蛋白质的研究。由于其岩石般的稳定性，这种蛋白质已经成为冷冻电镜的专属实验样品：之前的纪录是分辨率为1.54 Å的蛋白质结构。剑桥大学A. Radu Aricescu、Sjors H. W. Scheres等；马克斯·普朗克生物物理化学研究所Holger Stark等报道了对冷冻电子显微镜的固件、拍照方法升级，主要通过更换电子源、电子能量过滤器、调整照相过程，实现了分辨率的优化。马普所Holger Stark等通过球差校正、含有能量过滤器的单色仪结合、将照射到样品上的电子的能量限定在一定范围内，实现了对成像分辨率的改善。剑桥大学A. Radu Aricescu、Sjors H. W. Scheres等借助冷场发射电子枪优化入射电子的品质，同时将对样品成像作用有害的电子筛除，降低了噪音对样品成像的影响，还使用了新型高灵敏度电子探测器进行成像。最终，研究人员在对人膜蛋白进行成像的过程中实现了1.7 Å的分辨率，加强了对对人膜蛋白中小分子配位环境、溶剂分子、氨基酸的多种构象、酸性侧链/聚糖的确切结构进行理解。在对去铁铁蛋白进行成像的过程中，实现了1.22 Å的分辨率。虽然还不能看到氢原子，但是能够对大量氢原子的散射势垒进行成像，帮助研究者探索蛋白的氢键网络结构。无论是生物，还是化学、材料研究中，原子尺度的精准表征，都对分子和原子结构的排列、组成、构建的研究至关重要。只有取得了分子的精确结构和组成，才能对生理学、化学过程进行直观明确的验证。冷冻电镜除了在生物研究中大显身手，在材料和化学领域也能够实现传统透射电子显微镜技术无法实现的应用，包括电池界面电极/电解质观测、有机/无机界面观测、DNA/超晶格自组装、催化、MOF材料、量子材料等。然而，和X射线晶体学技术相比，冷冻电镜不仅通量小，而且价格贵，维护成本高。这些优势使X射线晶体学更适合于科学研究。为了让冷冻电镜不那么让人高攀不起，科学家一方面追逐更高的分辨率，一方面也在追求更快速、更便宜、更好用的冷冻电镜技术。2019年12月26日，颜宁教授团队简单改变了石墨烯grids的制备方法，帮助冷冻电镜上了一个新台阶。他们采用一种简单的策略，可制备出单层石墨烯覆盖率高达99％的冷冻电镜专用网格，超过70％的网格可用于采集有效数据，从11000个颗粒中，研究团队以目前最小的蛋白质为例，获得了超高分辨率：2.6 Å（也就是0.26 nm）。为了增加冷冻电镜处理数据的通量，并极大地降低成本以加速科学研究发现，MRC分子生物学实验室Christopher J. Russo等人报道了一种全新的支撑膜，不仅可以提高图像质量和收集效率，而且成本大幅降低。与传统支撑膜相比，HexAuFoil的核心设计在于：
1）使这些孔变小（直径为200至300 nm），并将它们更紧密地堆积在一起，这样极大地提高了数据通量。每次载物台移动可获取200张图像，使用适当配置的显微镜，甚至可以获取多达800张图像。2）通过最大程度地减少辐射损坏和样品移动造成的信息损失，来提高数据质量。分析表明，成像过程中样品运动的主要原因是玻璃化冰层的弯曲。于是，研究人员根据孔径，设计了具有最佳基材厚度的支撑膜，从而将样品在曝光过程中的总运动幅度降低至<1 Å。这样，研究人员可以在样品被辐射损坏之前，用数学方法将数据构建成到三维地图。1）这项技术，让冷冻电镜的原子级分辨率更加普适，可以应用于更多不稳定的蛋白质。正如上文提到，德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所的生物化学家和电子显微镜学家Holger Stark团队，和英国剑桥分子生物学医学研究委员会实验室(MRC-LMB)的结构生物学家Sjors Scheres和Radu Aricescu使用标准支撑膜，第一次真正实现了原子级冷冻电镜重建，但是他们所使用的是一种稳定的蛋白质：脱铁铁蛋白。使用软件校正光束，可以调控运动对图片质量和分辨率的影响，但是无法提供更高的数据处理通量。在原子尺度的分辨率下，分辨率每提高半个Å，就会打开一个新的宇宙。真正的原子分辨率，加上更加务实和亲民的操作和价格，这些不断取得的新突破，将进一步推动冷冻电镜作为大多数结构研究的霸主地位。然而，在科学的世界，没有神坛，也没有什么能够永远称霸天下。每种技术仍然有优缺点，冷冻电镜想要完全取代X射线晶体学，为时尚早！【1】Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM, Nature 2020DOI: 10.1038/s41586-020-2833-4https://www.nature.com/articles/s41586-020-2833-4【2】Nakane, T., Kotecha, A., Sente, A. et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution, Nature 2020DOI: 10.1038/s41586-020-2829-0https://www.nature.com/articles/s41586-020-2829-0【3】Mark A. Herzik Jr, Cryo-electron microscopy reaches atomic resolution, Nature 2020DOI: 10.1038/d41586-020-02924-yhttps://www.nature.com/articles/d41586-020-02924-y【4】Katerina Naydenova et al. Cryo-EM with sub–1 Å specimen movement. Science 2020, 370, 223-226.https://science.sciencemag.org/content/370/6513/223【5】Yimo Han, Nieng Yan et al. High-yield monolayer graphene grids fornear-atomic resolution cryoelectron microscopy. PNAS 2019.https://www.pnas.org/content/early/2019/12/24/1919114117
