Nature Nanotech突破后再发子刊，西南医学中心高金明团队新进展！

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2020-11-20

pH响应的功能材料可以通过感知肿瘤微环境的变化并做出响应，从而提高诊断或治疗效果。然而，对于许多生物过程，pH值的变化非常小（< 0.5个pH单元），基于小分子或非协同型聚合物的传统pH响应体系无法有效对这么细微的pH差异作出反应。

近十年来，美国德克萨斯大学西南医学中心高金明教授课题组一直致力于开发可协调的pH超敏感（ultra-pH sensitive, UPS）聚合物，对特定的、及其微小的pH变化范围具有敏锐响应。这些UPS纳米颗粒已经在多种生物学应用中发挥重要作用。其中一种聚合物PC7A及其纳米颗粒，可以结合并激活干扰素基因刺激物（STING），由它制备的纳米疫苗显著提高了抗肿瘤免疫力（详情参考：Luo, M. et al. A STING-activating nanovaccine for cancer immunotherapy, Nat. Nanotech. 2017, 12, 648-654.）。可是，有些功能材料不可降解，多次注射会在生物体内大量积累而产生毒性，一定程度上限制了今后的临床转化。

走向降解

为了解决这一问题，该组在原先UPS理念的基础上开发出一系列可降解的pH超敏感（degradable ultra-pH sensitive, dUPS）聚合物。具有水解活性聚碳酸酯作为聚合物骨架，最终分解产生无毒的小分子醇和二氧化碳，易于排出体外；侧链则结合不同烷基链长或不同结构的质子化叔胺（R∙HCl），赋予聚合物的pH超敏感性和可调节的pH转变点。

研究发现，这一系列dUPS聚合物保留了pH超敏感的性质，能够对极其微小的pH变化作出敏锐反应，其中代表性聚合物PSC7A在抗原呈递和抗肿瘤能力方面与“明星”PC7A纳米疫苗相当，并且显示出更低的系统毒性。更重要的是，dUPS聚合物具有水解活性，其降解动力学具有pH依赖性。长期安全性评估表明，与不可降解的PC7A相比，可降解的PSC7A在最大程度降低宿主反应和异物反应方面具有巨大优势：不可降解的PC7A会引起肉芽肿性炎症，并在注射部位持续数月不会消失，而可降解的PSC7A在引发短暂的急性炎症反应之后，聚合物降解使得组织完全愈合。相关成果发表在最近的Nature Communications上，题为“Polycarbonate-based ultra-pH sensitive nanoparticles improve therapeutic window”。

研究亮点：

1.开发出新型可降解的pH超敏感聚合物及其纳米颗粒体系，能够对不同pH转变点附近的微小pH变化作出敏锐反应，同时具有水解活性。

2.其中代表性聚合物PSC7A与肿瘤抗原制备的纳米疫苗可以有效呈递肿瘤抗原并具有强大的抗肿瘤免疫力。

3. PSC7A显著改善纳米疫苗的安全性和生物相容性。

pH超敏感性是由胶束化相变过程驱动的

研究人员通过开环聚合、点击化学等方法开发出一系列具有相同聚碳酸酯主链，不同结构叔胺侧链的聚合物（图1a）。其中蓝色部分为亲水的PEG，起到稳定作用；绿色部分为聚碳酸酯骨架，具有水解活性；红色部分为不同碳链链长或结构的质子化叔胺，用以调节不同的pH转变点（图1b），从5.2到7.7不等，广泛覆盖一般生理学pH范围。

研究表明，这一系列聚合物的pH超敏感性是由胶束化相变过程驱动的。dUPS聚合物的表观pH转变点与其侧链叔胺的疏水性呈反线性相关关系（图1c），具有较高疏水性的侧链的dUPS聚合物表现出较低的pH转变值。其中代表性聚合物PSC7A的动态光散射结果显示（图1d），当该聚合物的质子化程度高于90％时，聚合物链以单链形式存在，平均流体动力学直径低于10 nm，而当质子化程度降低到90％以下时，聚合物链立即自组装形成胶束。研究人员引入临界胶束质子化程度（CMPD）的概念，当质子化程度低于CMPD时，聚合物链开始自组装形成胶束。对于这些dUPS聚合物而言，CMPD值可高达90％。透射电子显微镜和动态光散射的结果都很明显的显示，当PSC7A 的质子化程度为95%（高于CMPD）时，聚合物只有单链，而当质子化程度降低到85%（低于CMPD）时，胶束形成。这一相变的过程是非常迅速和灵敏的。这些结果都进一步证明在这种独特的pH敏感纳米材料中，胶束化相变是协同pH响应的驱动力。

图1 | dUPS聚合物的pH超敏感性是由胶束化相变过程驱动的

PSC7A纳米疫苗可以有效递送肿瘤抗原并具有强大的抗肿瘤免疫力

等温量热滴定法（ITC）结果表明，侧链为环形叔胺的dUPS聚合物比侧链为线形叔胺的聚合物表现出更强的STING结合能力和干扰素诱导能力，其中以PSC7A最佳。由PSC7A和肿瘤抗原物理混合制备的纳米疫苗，pH超敏感的特性在其药理特性中发挥重要作用，因为聚合物以胶束形式通过物理引流输送至在淋巴结驻留的抗原呈递细胞。聚合物一旦被内吞，pH超敏感性使得纳米颗粒在早期的内体成熟过程中解体，破坏内体膜，使PSC7A聚合物能够活化STING，并将负载的抗原呈递到MHC I。

健康小鼠的流式结果表明，载有抗原的PSC7A 纳米颗粒可以增加CD80⁺树突状细胞和细胞毒性CD8⁺T细胞的百分比。小鼠体内实验结果表明，PSC7A纳米疫苗可以在TC-1和B16F10两种肿瘤模型中有效诱导强大的抗肿瘤免疫力，显著提高小鼠的存活率（图2）。PSC7A纳米疫苗与“明星”PC7A纳米疫苗具有相当的抗肿瘤能力。

图2 | PSC7A纳米疫苗可抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长并延长其存活时间

图3 | PSC7A的降解动力学。

PSC7A聚合物显著改善安全性和生物相容性

与不可降解的UPS聚合物相比，dUPS的主要优势在于其可降解体系的安全性。聚碳酸酯的主链赋予dUPS聚合物水解活性，使得聚合物在水性环境中自发降解为生物相容性PEO链段和无毒小分子。

研究人员用水相核磁进行降解动力学研究（图3），结果表明，在pH 7.4下水解发生的速率比在6.5时慢（t_1/2分别为27和12 天），这是由于PSC7A聚合物链在pH 7.4时胶束化，限制了水分子进入碳酸酯基团，而在pH 6.5时聚合物为单链，可降解的碳酸酯基团暴露在水环境中。体内短期安全性研究表明，PSC7A和PC7A均能在短期内诱导快速的先天炎症反应，PSC7A 纳米颗粒的系统细胞风暴水平低于PC7A 纳米颗粒。在长期安全性研究中，可降解的PSC7A对于不可降解的PC7A的优势更为突出。

研究人员对小鼠皮下注射PBS，大剂量的PSC7A 纳米颗粒或PC7A纳米颗粒，并连续观察60天（图4a）。给药后1天，研究人员在注射部位观察到PC7A和PSC7A都产生了大量急性炎症反应，可能是由于先天免疫刺激引起。研究人员通过椭圆模型计算得到的皮下结节的表面积，反映形成结节的大小（图4b）。最初的急性炎症反应后，皮下结节变小变坚硬，并逐渐转变为慢性肉芽肿性炎症反应。PSC7A诱导的结节比PC7A诱导的结节减小的速度更快，表明PSC7A聚合物正在降解并从注射部位排出。最终，PSC7A诱导的结节完全消失，注射部位的组织完全愈合。有趣的是，PSC7A诱导的结节，尺寸减小到一半的时间约为13天，与降解动力学结果一致（图4b）。相比之下，由PC7A诱导的结节大小减小直到给药后第45天，此后结节大小和外观保持恒定，在观察的60天内都没有消失。组织学分析表明，与用PBS处理的小鼠相比，用PSC7A处理的小鼠，其皮肤组织在结节完全消失后已经恢复到健康状态。这些结果都反映了PSC7A聚合物显著改善的安全性和生物相容性。

图4 | 可降解的PSC7A 纳米颗粒和不可降解的PC7A纳米颗粒长期安全性评估

小结：

这项研究报告了一系列可降解的pH超敏感（dUPS）聚合物的设计、合成、表征以及应用。该聚合物同时具有pH超敏感性和可降解性。其中一种代表聚合物PSC7A可以激活STING并传递抗原，显著产生T细胞介导的抗肿瘤免疫力。与不可降解的PC7A聚合物相比，PSC7A产生的系统毒性更低。大剂量皮下注射之后，不可降解的PC7A引起的肉芽肿状结节会在注射部位持续数月不能消失，而可降解的PSC7A诱导的结节会随着聚合物降解完全消失，注射部位组织完全愈合。这种可降解的pH超敏感聚合物及其纳米颗粒能够提高安全性和肿瘤治疗功效，为相关药物和蛋白质免疫治疗提供了新的机遇。

本研究的第一作者为美国德克萨斯大学西南医学中心的博士后Xu Wang，通讯作者为高金明教授

参考文献及原文链接：

Wang, X., Wilhelm, J., Li, W. et al. Polycarbonate-based ultra-pH sensitive nanoparticles improve therapeutic window. Nat. Commun. 11, 5828 (2020).

https://doi.org/10.1038/s41467-020-19651-7

通讯作者：

高金明，美国德克萨斯大学西南医学中心的教授。他带领的课题组的一项杰出成就是发明了“proton transistor” 技术，该技术可以数字化分析生物学和医学领域的酸信号。高教授与他的长期合作者，头颈癌外科医师Baran Sumer博士共同创立了OncoNano Medicine。荧光纳米颗粒传感器ONM-100已成功完成了对30位癌症患者的I期临床试验，并获得了FDA的快速批准，从而开始了全癌手术的II期试验。

近年来，研究团队已进入免疫肿瘤学领域。STING纳米颗粒疫苗（ONM-500）是其另一项发明，已从CPRIT获得1540万美元，用于HPV诱导的癌症的T细胞免疫疗法。作为美国国家癌症研究所癌症月球计划的一部分，高教授及其团队最近获得了U54纳米免疫工程中心奖，以开发创新的纳米疗法来促进癌症免疫疗法。