程柯课题组最新Nature Biomed. Eng.: 外泌体与血管支架的结合

奇物论

2021-04-29

急性心肌梗死主要是由冠状动脉堵塞而引起的心肌缺血坏死。据统计，中国目前每年新发急性心肌梗死患者约50万。不少急性心梗患者会错过发病后的黄金救治时间（发病后2小时内），而导致较差的预后甚至死亡。

自诞生以来，金属支架（bare metal stent, BMS）在急性心肌梗死的预防和治疗中得到了广泛的运用。植入的血管支架起到了血管再通，支撑狭窄血管，和改善血流的作用。然而，血小板能识别植入的金属外来物并触发支架内血栓的形成。此外，血管平滑肌细胞在金属支架的刺激下也会过度增殖。这些因素导致了金属支架较高的再狭窄风险（restenosis）。药物洗脱支架(drug eluting stent, DES）应运而生。这种支架在金属表面加了一层高分子涂层，能释放抑制细胞增殖的药物。药物洗脱支架降低了支架再狭窄的发生概率。但是，这些药物不仅抑制平滑肌细胞，同时也抑制血管内皮细胞，延长了其对支架的覆盖进程，降低了支架的安全性和有效性。无论是金属支架还是药物洗脱支架，其主要作用都是对血管提供物理支撑，不具备修复缺血受损组织的生物功能。

成果简介

为解决目前金属支架和药物洗脱支架的局限性，来自北卡大学教堂山分校和北卡州立大学的程柯教授课题组提供了一种崭新的思路，即外泌体洗脱支架（exosome eluting stent, EES）。间充质干细胞分泌的外泌体已被证明能促进内皮细胞修复，血管生成以及组织修复。作为细胞外囊泡的一种，外泌体具备类似细胞膜的双分子层膜结构，生物相容性高，免疫原性低。

课题组提出假设：

（1）当支架穿上了外泌体涂层这件类似细胞膜的“伪装迷彩服”后，能否提高其生物相容性？

（2）释放的外泌体能否促进支架的内皮化，降低支架再狭窄的风险？进而，这些外泌体能否促进下游组织修复？；

（3）能否利用血液中的损伤标志物（如活性氧自由基）控制外泌体的释放，起到“随叫随到”的效果？

 实验结果表明，外泌体涂层可以提高金属支架的生物相容性，促进血管内皮化。进一步研究发现，外泌体还可以抑制血管平滑肌细胞的迁移，减少炎症反应，从而减少再狭窄发生的概率。更有趣的是，部分释放的外泌体随血液到达下游缺血组织，促进了肌肉组织修复和再生。相关成果近期以研究论文的形式发表在Nature Biomedical Engineering上。博士后研究员胡诗琪博士和李振华博士为本文的共同第一作者，程柯教授是本文的唯一通讯作者。

支架设计

首先，利用活性氧自由基（ROS）响应基团将金属支架和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）相连，从而在温和条件下将外泌体均匀地连接在金属支架上。实验结果证明，支架表面结合了不止一层的外泌体。其结合的数目与支架表面积，聚乙二醇分子链长短以及孵育时间等有关。飞行时间二次离子质谱分析（ToF-SIMS）以及扫描电子显微镜（SEM）等表征说明外泌体被成功结合在支架表面。之后的实验证明了ROS能触发外泌体从支架上释放。

图1|外泌体洗脱支架的制备与表征

细胞实验

外泌体洗脱支架直接作用于内皮细胞和平滑肌细胞。作者首先研究了支架对内皮细胞迁移和增殖的影响。金属支架对于细胞增殖没有明显的促进或者抑制作用，药物涂层支架会产生一定的抑制效果，外泌体洗脱支架在体外实验中有效地促进了内皮细胞的增殖，迁移以及支架内皮化。更重要的是，间充质干细胞来源的外泌体能抑制平滑肌细胞的迁移。

图2|金属和外泌体洗脱支架对不同类型细胞的影响

大鼠腹主动脉植入实验

为观察外泌体洗脱支架的可行性和生物安全性，研究人员首先使用SD大鼠腹主动脉植入模型比对金属支架和外泌体洗脱支架。通过SEM电镜观察，发现外泌体洗脱支架可减少炎症细胞在支架上的富集。通过原位血管组织的PCR血栓相关基因的分析，发现外泌体洗脱支架的植入降低了部分血管组织内血栓相关基因的表达。

图3|SD大鼠腹主动脉植入金属支架或外泌体洗脱支架的对比实验

血管病理分析

通过血管切片病理分析，研究人员发现相较于金属支架组，药物洗脱支架和外泌体洗脱支架均减少了血管狭窄。然而，药物洗脱支架组的支架包覆率较低，而外泌体洗脱支架组具备更高的生物相容性和内皮化程度。

图4|金属支架，药物洗脱支架，和外泌体洗脱支架植入后血管病理分析

ApoE^-/- 大鼠腹主动脉植入实验

为模拟动脉粥样硬化，研究人员使用了ApoE^-/- 大鼠（高脂喂养）对比了不同支架对血管细胞的影响。结果显示：1）金属支架和药物洗脱支架组的内膜平滑肌细胞的α-SMA的表达非常不均匀，说明其不稳定，具有强的迁移力。而外泌体支架组的内膜平滑肌细胞α-SMA表达稳定，覆被均匀。2）金属支架和药物洗脱支架组的内膜中，均有很多新生的GluT1+的内皮细胞。这种内膜内的小血管可能会导致后期的血栓和再狭窄。3）外泌体洗脱支架减少了炎症反应。

图5|三种不同类型的支架植入ApoE^-/- 大鼠腹主动脉

ApoE^-/- 大鼠下肢缺血实验

研究人员在ApoE^-/-大鼠中植入支架的同时，也引入了单边的下肢缺血模型。结果证明金属支架和药物洗脱支架组类似，对于缺血部位没有治疗效果。而外泌体洗脱支架可以在一定程度上促进缺血部位的血管生成和肌肉再生。

图6|ApoE^-/- 大鼠下肢缺血模型中外泌体洗脱支架的治疗作用

仍存局限性

尽管取得了一些令人鼓舞的结果，但这项研究仍存在一些局限性。

1）首先，尽管可以通过优化连接基团来控制外泌体的数量，但外泌体的结合量仍然有限。未来可能还需要进一步引入涂层来结合更多的外泌体。

2）其次，所有实验均为小型动物的短期植入。尽管病理结果和基因分析均表明外泌体支架会减少血栓的发展，仍需要大动物长期植入实验来进一步判断支架的再狭窄风险。

3）第三， 目前外泌体的生产制备仍存在批次稳定性和临床转化的难度。

小结

总而言之，研究人员设计了一种新型的生物响应、生物活性支架。该支架无高分子聚合物，无抑制增殖药物，其生物相容性和治疗作用均来自于其表面的外泌体涂层。该支架相较于目前市场上的金属支架和药物洗脱支架，可促进血管的内皮化，减少炎症反应。更重要的是，该支架是一种具有生物治疗作用的支架，释放的外泌体可以随血液到达下游缺血损伤部位，促进损伤组织的再生。

参考文献：

Shiqi Hu. et al. Exosome-eluting stents for vascular healing after ischaemic injury. Nat. Biomed. Eng.

https://doi.org/10.1038/s41551-021-00705-0