不到1个月，谭蔚泓院士再发JACS!
奇物论
2021-06-15
JACS: 调节 Sgc8-Combretastatin A4 偶联物的抗癌功效核酸适体独特的优点，包括特异性、高结合亲和力、易于细胞内化和快速组织积累能力，使得核酸适体-药物结合物成为靶向给药最具吸引力的策略之一。然而，连接体在调节这些结合物的抗癌功效中的关键作用，特别是那些通过自动化模块化合成技术设计的结合物，却很少被探索。有鉴于此，湖南大学的谭蔚泓、王雪强等研究人员，报道了调控Sgc8-Combretastatin A4偶联物的抗癌效果：一个认识到连接体化学对设计基于适体的靶向药物递送策略的重要性的案例。1）研究人员利用Sgc8c适体和combretastatin A4开发了三种具有磷酸二酯键连接体、二硫键连接体或氨基甲酸酯连接体的共轭物来研究它们的有效载荷释放机制以及对抗癌疗效的影响。
2）这些研究使研究人员能够确定由谷胱甘肽的亲核攻击和由磷酸二酯酶引起的降解激活的磷酸二酯酶键连接子的与共轭物的较高细胞毒性高度相关的独特激活途径。对磷酸二酯键连接子活化化学的理解使人们能够进一步设计另一种XQ-2d-CA4偶联物，以更有效的方式诱导胰腺癌细胞凋亡。
值得注意的是，谭蔚泓院士、刘庄、杨宇等人于上个月在JACS上发表了另一重要成果！
免疫检查点阻断疗法（ICB）是通过阻断T细胞上PD1与癌细胞或抗原呈递细胞PD-L1结合，进而增强肿瘤临床免疫治疗效果的一种有效方法。目前，已有包括纳武单抗等在内的多种PD1或PD-L1抑制剂被批准用于临床治疗。尽管如此，ICB治疗仍然存在一些不足，比如脱靶效应和临床响应率偏低等。
于此，上海交通大学谭蔚泓院士、杨宇研究员和苏州大学刘庄教授提出了一种DNA逻辑计算介导的生物正交反应策略，实现了精准且长久的免疫检查点阻断治疗。只有当靶标细胞表面存在大量受体且通过代谢工程表达有叠氮糖修饰，符合“AND”逻辑门时，细胞表面受体才能与DBCO修饰的核酸适体发生生物正交反应，实现对靶标细胞的精准标记以及对免疫检查点的稳定阻断，达到精确和持续的抗肿瘤免疫治疗的目的。这种DNA逻辑计算介导的生物正交反应可以提高免疫检查点阻断（ICB）治疗的精确性和稳健性，同时，该方法也能够进一步拓展应用到光动力治疗和放射疗法等。
如图1所示，靶标细胞表面高丰度的受体蛋白PD-L1作为“天然受体”，通过糖代谢工程标记在受体蛋白上的叠氮糖作为“化学受体”。基于此，作者提出了一种基于DNA逻辑计算的生物正交反应，只有当细胞表面同时存在“天然受体”和“化学受体”时，DBCO修饰的抗PD-L1适体（DBCO-aPDL1 aptamer）才能够在识别PD-L1的前提下介导DBCO与叠氮的点击化学反应，从而将DBCO-aPDL1 aptamer共价交联到PD-L1上，实现有效和持续的免疫检查点阻断，提高免疫检查点阻断治疗效果。为了验证DNA逻辑计算介导的DBCO-适体核酸/叠氮糖-靶标蛋白之间的生物正交反应的特异性，研究人员选择了特异性高表达蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）的CCRF-CEM细胞作为靶标细胞，低表达PTK7的Ramos细胞作为对照细胞，并选择DBCO修饰的抗PTK7适体（D-sgc8）进行生物正交反应。结果如图2所示，对D-sgc8进行FITC荧光标记后，激光共聚焦成像（图2b）与流式细胞术（图2c）结果显示，仅D-sgc8和CCRF-CEM细胞共培养时才会出现明显的荧光信号，表明生物正交反应能够顺利进行。图2 用D-sgc8在活细胞表面构建生物正交逻辑回路受D-sgc8在靶细胞上高度精确表面工程的启发，作者进一步设计了DBCO修饰的抗PD-L1适体（D-aPDL1），用于提供有效和精确的免疫检查点阻断治疗（图3a）。具体来说，作者选用小鼠黑色素瘤细胞系B16F10作为靶标细胞，将Cy5标记的D-aPDL1与不同处理的靶标细胞孵育后，仅有INF-γ诱导、糖代谢工程化，表达有大量带有叠氮糖标记的PD-L1受体蛋白，的靶标细胞被稳定标记上了D-aPDL1（图3b-3d）。动物实验表明，Ac4ManNAz治疗组中，Cy5标记的D-aPDL1能在肿瘤中稳定保留72小时以上（图3e），远高于未经Ac4ManNAz处理的对照组（图3f）。因此，这种“AND”逻辑计算生物正交反应可介导D-aPDL1与肿瘤细胞表面叠氮糖标记的PD-L1受体的共价结合，实现核酸适体在肿瘤内的长期保留，从而提供精确和长期的免疫检查点阻断治疗。为了验证治疗效果，作者将B16F10肿瘤小鼠分为六组进行实验（图4a），对比不同实验组的肿瘤大小（图4b, 4c），存活率（图4d）、体重（图4e）变化。结果表明，Ac4ManNAz治疗对肿瘤生长的影响不大，但同时静脉注射或肌肉注射D-aPDL1的实验组小鼠均表现出有效的肿瘤生长抑制作用，并能够显著提高了小鼠的存活率。对主要器官的组织学检查进一步证实了D-aPDL1适体具有良好的生物相容性（图4f）。因此，DNA逻辑计算介导的生物正交反应可以实现精确、长期的检查点阻断免疫治疗。图4 基于D-aPDL1的体内精确检查点阻断免疫治疗的逻辑回路为评价T细胞介导的免疫应答效果，作者采用流式细胞术分析了不同实验组的肿瘤浸润淋巴细胞。结果显示，与D-aPDL1治疗组相比，无论肌肉注射或静脉注射D-aPDL1，Ac4ManNAz处理组肿瘤中T细胞显著增加（图5a-5c），与效应T细胞增殖和生长密切相关的细胞周期相关蛋白（Ki67）表达也在治疗后显著升高（图5d, 5f），CD8+ T细胞内Graz B的表达显著增强（图5e, 5g），小鼠肿瘤中细胞因子水平显著增强（5h, 5i）。这些结果共同证实了该策略诱导产生了的有效的适应性免疫应答。通过“AND”逻辑反应将D-aPDL1共价结合在肿瘤细胞上，可以使其长期保留在肿瘤部位，从而触发持续而强大的T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗。在光动力治疗上，利用光敏剂PA（焦磷酸叶绿素-A）在近红外光照射下产生单线态氧的特点，将PA与适体结合得到DBCO-sgc8-PA（D-sgc8-PA）。在证明其对细胞毒性和靶向功能后，作者进一步研究了D-sgc8-PA的靶向治疗效果，如图6a所示，与对照组相比，只有当PTK7和偶氮标记同时存在时，D-sgc8-PA才能在细胞表面共价修饰，显示出最高的癌细胞杀伤效率。在放射治疗领域，将放射性同位素99mTc4+用螯合剂DOTA与适体相连得到D-sgc8-DOTA适体，由于99mTc4+与DOTA之间有很强的配位作用，孵育60分钟后得到高放射性标记稳定的D-sgc8-DOTA-99mTc4+（D-sgc8-99mTc）。如图6b所示，通过逻辑计算将D-sgc8-99mTc共价标记在靶标细胞上时显示出最高的杀伤效果。用γ-H2AX评估DNA损伤（图6c），结果表明D-sgc8-99mTc共孵育的叠氮标记的CCRF-CEM细胞中检测到显著增强的DNA损伤。因此，该策略可介导的长期治疗，并显示出强烈的增强疗效。图6 DNA逻辑运算介导的精准光动力治疗和放射治疗总之作者设计了一个简单而通用的策略来提高肿瘤治疗的效率和精确度。这种新的方法是通过将基于适体的特异性识别能力与基于叠氮化合物/DBCO的生物正交化学结合起来实现的。以免疫检查点阻断疗法为例，将叠氮糖作为“化学受体”结合到细胞表面糖蛋白“天然受体”上，使核酸适体与癌细胞发生共价交联，能够有效触发精确和持续的抗肿瘤免疫治疗。这种DNA逻辑计算介导的生物正交反应策略可以进一步扩展应用于精准的光动力治疗或放射治疗。https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c02016
Zhiyong Huang, et al. Regulating the Anticancer Efficacy of Sgc8–Combretastatin A4 Conjugates: A Case of Recognizing the Significance of Linker Chemistry for the Design of Aptamer-Based Targeted Drug Delivery Strategies. JACS, 2021.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c03013
