化学探针，登上Nature Chemistry封面！

奇物论

2021-07-03

蛋白质和核酸之间直接和协调相互作用的复杂网络在许多细胞过程的调节中至关重要，例如基因表达、DNA 复制或 DNA 修复。可以在天然染色质环境中询问这些相互作用网络的稳健方法是了解潜在分子机制的关键。目前尽管有一些成功的例子，但相对缓慢的标记动力学、毒性和工程融合蛋白的大小可能会阻碍其适用性和空间分辨率。

相比之下，小分子交联剂的光活化允许精确控制反应和更短的标记时间，以提供相对较低的背景结合和良好的空间和时间分辨率。在基于亲和力的蛋白质分析中，小分子与光交联剂相连，后者介导原位与细胞蛋白质靶标的不可逆结合，然后通过定量蛋白质组学进行表征。然而，迄今为止，此类方法已被用于绘制药物或小分子片段的直接蛋白质相互作用物，而不是相互作用网络。因此，非常需要绕过这些限制并提供特定功能基因组位点蛋白质相互作用的更全面视图的新策略。

DNA G-四联体 (G4s) 是非规范的四链核酸结构，在某些富含 G 的序列中包含堆叠的 G-四联体。DNA G4s 已被证明存在于人类细胞中，它们的形成在活细胞中是动态的。多种蛋白质，如解旋酶、转录因子和表观遗传调节剂，已被证明在体外与 DNA G4 相互作用。

成果简介

鉴于此，剑桥大学Shankar Balasubramanian等人报告了一种共结合介导的蛋白质分析 (co-binding-mediated protein profiling, CMPP) 方法，用于研究活细胞中的 DNA G4 相互作用组学。成果发表在Nature Chemistry上，并作为该期封面文章！

图|CMPP 示意图

探针设计

在细胞中结合多种 G4 DNA 靶结构的小分子可以被功能化，以允许在其天然环境中以最小的扰动绘制 G4 相互作用蛋白。该探针设计基于吡啶抑制素 (PDS)，这是一种高度 G4 选择性的小分子配体，已广泛用于靶向细胞中的 DNA 和 RNA G4。之前研究表明，PDS 衍生物和蛋白质可以在体外同时结合 G4，这成为检测共结合蛋白的有前途的分子支架。

研究人员制备了两种 G4 配体探针，photoPDS-1 (1) 和 photoPDS-2 (2)，通过将 PDS 连接到点击炔柄和一个光反应性脂肪族二氮嗪基团上，该基团小且具有优异的化学稳定性、光标记效率和低背景结合。探针 1 有一个短的双碳接头，探针 2 有一个双单元聚乙二醇较长的接头（12 个原子），可以探测距 G4 结合位点不同距离的蛋白质。此外，还准备了一个缺乏 G4 结合部分的可光活化对照 3。

结果显示，1 和 2 表现出与不同 G4 结构的强选择性结合。相比之下，3 没有表现出明显的 G4 结合。

图|体外共结合介导的 G4 结合蛋白的邻近捕获

可结合多种蛋白

使用该方法，研究人员确定了数百个 G4 相关蛋白，其中一些是已知的 G4 结合剂，而许多以前没有描述过。几种新的 G4 结合蛋白分别通过体外试验进行了验证，并证明是特异性的、高亲和力的 G4 结合蛋白。鉴于它们在生物过程中的独特特性和各种功能，这些蛋白质可能在内源性G4形貌和G4生物学的调节中发挥不同的关键作用。

蛋白质 SMARCA4 是染色质重塑复合物的一部分，使用基因组 ChIP-seq 方法进一步跟踪，以证明 SMARCA4 确实与已检测到 G4 结构的基因组位点有实质性结合。这一结果证实了该 CMPP 方法确实识别了与细胞染色质中 G4 结构结合的蛋白质，特别是在基因启动子上，并且还暗示 SMARCA4-G4 相互作用可能对转录控制很重要。涉及蛋白质敲低或过表达以及 G4 ChIP-seq 的进一步实验可能最终有助于更详细地阐明相关机制。

图|人类细胞中 G4 相互作用组的分析

小结

总的来说，该化学方法表明，它可以为活细胞中核酸结构特征相互作用蛋白的全局定位提供一种无偏策略。虽然这项研究主要集中在DNA-G4相互作用，但研究人员也发现了一些被注释为RNA结合蛋白的候选基因。PDS可以以相似的亲和力结合DNA和RNA G4s，因此，一些已鉴定的蛋白质原则上可能与核RNA G4s结合。设想未来对RNA G4特异性问题的研究可能会采用类似的方法来探索内源性RNA G4蛋白质相互作用。研究人员还设想一般原则将使进一步研究能够绘制其他核酸结构特征的内源性相互作用组。

参考文献：

Zhang, X., Spiegel, J., Martínez Cuesta, S. et al. Chemical profiling of DNA G-quadruplex-interacting proteins in live cells. Nat. Chem. 13, 626–633 (2021).

https://doi.org/10.1038/s41557-021-00736-9