怒赞！脂质纳米颗粒，进入临床试验！

奇物论

2021-09-16

在基因编辑时代之前，引入功能性基因拷贝是成功治疗常染色体隐性单基因疾病的唯一可用策略，例如基因治疗药物的市场批准都依赖于这一概念。然而，这很少适用于常染色体显性疾病，因为显性负效应只能通过等位基因特异性下调策略来治疗。

设计的核酸酶，尤其是由 Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 开创性工作开创的 RNA 引导的 CRISPR-Cas9 系统，可以被视为游戏规则改变者，因为它们为解决潜在缺陷的精确基因组修饰提供了机会。尽管这种方法在动物模型中被证明是有效的，但转化为人体临床试验仍然是全球研究的一个非常活跃的领域。

转甲状腺素蛋白淀粉样变性是一种危及生命的疾病，由错误折叠的转甲状腺素蛋白 (TTR) 蛋白在神经和心肌细胞中积累为淀粉样原纤维，最终导致淀粉样多发性神经病、心肌病或两者的组合。

NLTA-2001 是一种药物，它利用 CRISPR-Cas9 系统抑制肝脏中 TTR 的产生。具体来说，具有肝趋向性的脂质纳米颗粒 (LNP) 装载有编码内切核酸酶 Cas9 的 mRNA 和相应的单向导 RNA（CRISPR-Cas9 系统）。静脉给药后，这些颗粒在体内转导肝细胞并通过 CRISPR-Cas9 活性来抑制TTR，随后发生非同源末端连接 DNA 修复事件。肝细胞的趋向性是通过载脂蛋白 E 引导的，它介导 LNP 与低密度脂蛋白 (LDL) 受体的结合。

成果简介

近日，伦敦大学学院Julian D. Gillmore等人报告了使用NLTA-2001给药的1期临床研究的结果。表明，单次给药 NLTA-2001 足以将患者的血清 TTR 水平降低多达 96%，这揭示了这一战略的效力。这种TTR水平的降低，如果持续的话，有望改善疾病症状，并提供强有力的证据证明基因编辑已经在临床发展中达到下一个水平。该1期临床研究发表在New England Journal of Medicine (NEJM)杂志上，另外，Nature Medicine对此进行报道。

NLTA-2001作用过程

与已批准用于临床的其他LNP一样，NTLA-2001预计将被肝细胞表面表达的低密度脂蛋白（LDL）受体摄取，之后是胞吞和内吞体的形成。LNP分解和内吞体膜破坏后，活性成分（TTR特异性sgRNA和Cas9编码mRNA）被释放到细胞质内。Cas9 mRNA分子通过天然核糖体过程翻译，生成Cas9核酸内切酶。TTR特异性sgRNA与Cas9核酸内切酶相互作用，形成CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物。

Cas9核糖核蛋白复合物通过入核转运的方式进入细胞核，并在细胞核内识别TTR中非互补DNA链上的前间隔序列邻近基序（PAM）。sgRNA 5'末端的靶基因特异性20个核苷酸序列在靶位点与DNA双螺旋结合，使CRISPR-Cas9复合物解旋并接近靶基因。Cas9经历了一系列构象变化和核酸酶结构域（HNH和RuvC结构域）激活，使DNA裂解，并精确靶向由sgRNA互补序列定义的TTR序列。内源性DNA修复机制连接切口末端，有可能引入碱基插入缺失（indel）。插入缺失可能导致功能性靶基因mRNA水平降低（原因是错义或无义突变减少了全长mRNA的数量），最终导致靶蛋白水平降低。

图|NTLA-2001的作用机制（自NEJM中文版）

肝脏作为靶组织的优势

当前该研究为将基因治疗方法推向更高水平奠定了基础，因为基因编辑从离体基因治疗转向体内基因治疗。使用肝脏作为治疗靶组织和 TTR 作为靶基因是实现体内基因编辑临床第一步的明智之举，因为肝脏相对容易通过携带载脂蛋白 E 的 LNP 靶向，并且 TTR 几乎仅在肝细胞中表达（> 99％）。此外，患病等位基因和健康等位基因的破坏不会产生重大的病理后果，因为野生型 TTR 的唯一已知功能是视黄酸的转运，其损失可以通过补充维生素 A 来克服。

图|基于 CRISPR–Cas9 的基因编辑的体内和体外策略

展望：

展望未来，考虑到个性化离体基因治疗面临的挑战，体内基因治疗以及“现成的”离体修饰基因治疗药物被认为是为所有有需要的患者提供基因治疗的可行选择。除了高质量和与人类白细胞抗原相容的供体细胞的可用性及其生产所需的时间之外，离体基因治疗策略还依赖于具有移植经验和符合良好生产规范的细胞修饰设施的专业治疗中心。

而体内基因治疗则解决了这些问题，并且可能会降低此类策略的总体成本，这反过来又会影响这些将改变医学领域的创新治疗方案的可用性。实现这一目标的先决条件是提供量身定制的载体系统，该系统能够准确、高效和安全地将治疗性物质输送到所选的靶细胞中。针对非病毒载体（例如，使用 LNPs）和病毒载体的一系列策略已经成功开发，并且正在不断努力。尽管在提高靶细胞转导效率方面的结果特别有希望，但细胞表面靶向实验的结果表明，原则上可以实现无脱靶效应的靶向递送，但这取决于细胞类型特异性受体。目前的研究已经利用这一策略，通过靶向 LDL 受体来提高 mRNA 递送至肝细胞的效率。

尽管目前的数据处于研究的早期阶段（即治疗后 28 天），但在疗效和缺乏治疗相关的严重不良事件方面，初步结果令人印象深刻。然而，仍然需要进一步的数据来充分表征这种基因治疗方法的有效性、持久性和安全性。

参考文献：

1. Gillmore JD, Gane E, Taubel J, et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med 2021;385:493-502.

https://doi.org/10.1056/NEJMoa2107454

2. https://nejmqianyan.cn/article/YXQYoa2107454?sg=AbW1NGsHw3NxPd6F

3. Büning, H., Schambach, A. A first step toward in vivo gene editing in patients. Nat Med (2021).

https://doi.org/10.1038/s41591-021-01476-6