光热纳米纤维，登上Nature Nanotechnology！
奇物论
2021-11-04
许多生物技术和生物医学应用依赖于工程细胞，这需要在体外或离体细胞内递送大分子，如 DNA、RNA 或蛋白质。为了克服化学转染试剂或病毒载体的局限性，新的和改进的物理转染技术的发展显著激增，所有这些技术都旨在实现体外或离体的有效细胞转染，并尽可能降低细胞毒性。其中，纳米颗粒 (NP) 敏化光穿孔，或简称光穿孔，是一种特别有前景的物理转染方法，提供了效率、安全性和灵活性的独特组合。然而，在生产用于治疗应用的工程细胞时，由于 NPs 的存在，光穿孔的使用与安全性和监管问题有关。已经表明，在使用 Au NPs 进行光穿孔后，即使经过严格洗涤，大量Au仍与这些细胞相关，而且在使用氧化铁纳米颗粒时也是如此。因此，从监管的角度来看，通过 NP 致敏光穿孔工程改造的细胞将被归类为“中等暴露的长期侵入性医疗器械”，需要对其进行广泛的生物相容性测试。如果可以在不将细胞暴露于 NPs 的情况下进行光穿孔，它将被归类为“低暴露的短期非侵入性医疗设备”，只需要进行最低限度的生物相容性测试。鉴于此，南京林业大学黄超伯、熊燃华联合比利时根特大学Kevin Braeckmans、Stefaan C. De Smedt等人提出了一种基于光热电纺纳米纤维 (PEN) 的简单方法。通过在生物相容性电纺纳米纤维中嵌入光敏纳米颗粒，可实现类似传统的纳米颗粒敏化光穿孔一样进行光热效应诱导膜通透性，而无需细胞与纳米颗粒直接接触。成果发表在Nature Nanotechnology上。
纳米纤维是由聚己内酯 (PCL) 和氧化铁纳米颗粒(IONPs)以不同重量百分比溶解在DMF- THF中的混合物制备的。该混合物用于纤维的静电纺丝，纤维收集在安装在接地旋转收集器上的显微镜载玻片。研究人员首先表征了嵌入电纺纳米纤维中的IONPs的形态、密度和分布。
图|光热纳米纤维细胞内递送的概念和光热电纺纳米纤维的表征接下来，研究人员确定在用纳秒激光脉冲照射 PEN 后，不仅可以在贴壁细胞实现安全有效地转染一系列大分子（如10 kDa 葡聚糖），还可以用于悬浮细胞。值得注意的是，PEN 底物可以重复激光激活，可导致递送效率逐渐提高。此外，通过电感耦合等离子体串联质谱法 (ICP-MS/MS) 进行的元素分析表明，激光照射后没有 IONPs 泄漏到细胞培养基中。还有，从嵌入的 IONP 到细胞膜的热传递的数值模拟使能够了解激光脉冲能量密度、IONP 聚集状态和纳米纤维内的分布如何影响细胞膜通透性。图|PEN 光穿孔使大分子能够安全有效地输送到细胞在成功递送模型大分子后，研究人员研究了 siRNA和CRISPR-Cas9系统作为功能性大分子的递送。研究发现通过 PEN光穿孔在贴壁细胞中进行有效的基因沉默或敲除。这表明PEN 光穿孔不仅能够输送相对较小的生物分子，如 siRNA，还能够输送相当大的大分子复合物，如 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白 (RNP)。值得注意的是，PEN 光穿孔细胞能够立即恢复并呈指数增长，就像未经处理的细胞一样。然而，电穿孔细胞需要 4 天才能恢复指数生长。图|PEN光穿孔用于 siRNA 基因沉默或 CRISPR-Cas9 介导的基因敲除此外，研究人员还证明了使用 PEN 光穿孔技术可以对胚胎干细胞和人类 T 细胞等难以转染的细胞进行基因工程改造，而且不会改变体外 T 细胞稳态和功能。重要的是，利用该技术对CAR T细胞进行改造，通过体内实验观察到用siPD1进行PEN光穿孔的CAR T细胞能够在 21 天后显着减小肿瘤体积，这证实了PEN 光穿孔 T 细胞完全保留了其治疗潜力，并且 siRNA 介导的 PD1 受体敲低可为实体瘤的治疗提供治疗优势。综上所述，PEN 能够在多种细胞类型中实现细胞膜透化，而无需接触具有潜在毒性的光热纳米粒子，从而为使用光穿孔技术安全有效地生产基因修饰细胞疗法铺平了道路。此外，已经证明，这种方法可以有效地诱导干细胞中的基因敲除和原代人类 T 细胞中的基因沉默，表明 PEN 光穿孔具有临床转化的潜力，例如用于细胞治疗的工程细胞的产生，包括干细胞治疗或过继性 T 细胞疗法。Xiong,R., Hua, D., Van Hoeck, J. et al. Photothermal nanofibres enable safeengineering of therapeutic cells. Nat. Nanotechnol. (2021).https://doi.org/10.1038/s41565-021-00976-3
