新思路！改造细胞作递送载体！

奇物论

2022-01-04

第一作者：Huawei Wang, Christina N. Alarcón

通讯作者：Richard L. Klemke

通讯单位：加利福尼亚大学

研究背景：

如何将药物有效递送至疾病部位一直是科研人员的研究热点。高效递送药物至疾病部位能够极大提高药物利用度并降低对机体产生的副作用。细胞因子（如IL-10、 IL-12）具有强大的免疫调节功能，在炎症治疗方面发挥着重要作用，但是这些细胞因子在循环中的半衰期短，在靶组织中的生物利用度低，以及与全身给药相关的不良反应阻碍了其在临床进一步推广。

无细胞载体凭借其高生物相容性，高变形性，来源广等优点迅速成为药物递送载体选择的宠儿。目前已知的无细胞载体主要包含各种细胞来源的外泌体，细胞膜挤出囊泡，细菌囊泡，红细胞等，他们在癌症、炎症等相关疾病治疗药物递送方面发挥着重要作用，但其在临床使用过程中也暴露出疾病部位靶向不足，以及在循环中泄露的治疗药物会造成严重副反应，这些不利因素严重干扰无细胞载体在临床中的进一步推广。除了无细胞载体外，科研人员也尝试利用全细胞进行递送药物，利用细胞的相关生物功能，靶向至疾病部位，如骨髓间充质干细胞利用趋化因子浓度梯度向炎症组织归巢，将药物递送至炎症部位。但是随着研究的深入，发现尽管骨髓间充质干细胞等细胞具有天然的疾病趋向特性，但静脉注入后骨髓间充质干细胞对靶组织的归巢不一致且不充分。因此结合无细胞载体与真核细胞载体两者的优势有望打造出一种高效的炎症靶向递药载体。

成果简介：

研究人员对人间充质基质细胞进行基因工程化修饰，使之表达趋化因子受体和内皮细胞结合分子，然后通过密度梯度离心去除细胞核，实验发现这种去除细胞核的间充质基质细胞是靶向给药的有效载体。

去核细胞既不能增殖，也不能永久性地移植到宿主体内，但仍能保留细胞器以产生能量和蛋白质，通过整合素调节粘附到发炎的内皮细胞上，并积极地响应病变组织建立的趋化因子梯度。在急性炎症和胰腺炎的小鼠模型中，系统给药的去核细胞表达两种类型的趋化因子受体和内皮粘附分子，增强了抗炎细胞因子向病变组织的传递（相对于未修饰的基质细胞和来源于骨髓基质细胞的外泌体），减轻炎症，改善疾病病理进程。去核细胞保留了细胞的大部分功能，并获得了无细胞递送系统的载货特性，因此代表了一种多功能输送载体和治疗系统。

要点1. 去核间充质细胞（货细胞）保留母细胞重要细胞器以及相应细胞功能

研究人员利用基因工程技术首先使人间充质干细胞（hT-MSC）表达趋化因子受体以及内皮细胞结合分子，然后利用密度梯度离心获取去核细胞-货细胞（Cargocytes）（图1a）。相比于hT-MSC，Cargocytes在细胞染色中未观察到核酸，表明其已经完全去除掉细胞核，并且在尺寸上，Cargocytes比全细胞更小（图1b-d）,由于已经去掉细胞核，因此相比于全细胞，Cargocytes并没有增殖能力（图1e）。另外研究人员发现全细胞以及Cargocytes的培养基上清中都可以分离得到外泌体，并且两者都具有相似的杯状结构，两种外泌体在粒径分布以及电位方面并没有显著性差异（图1f-h）。在导入GFP-mRNA后，两者都表达出GFP蛋白，并且在荧光强度方面并没有显著性差异（图1i-k），说明Cargocytes具有完整的翻译功能。

图1. Cargocytes具有完整的细胞功能

要点2. Cargocytes具有趋化活性，能更好地通过狭窄通道

首先研究人员利用Boyden小室实验以及微流体压缩通道迁移实验表明，在FBS密度梯度下，hT-MSC以及Cargocytes均表现出FBS密度梯度趋化特性，但是有趣的是，在微流体压缩通道迁移实验中，相比于hT-MSC，Cargocytes表现出更好地迁移效果，原因主要是由于去除细胞核后，Cargocytes刚性降低，使其具有更强的变形能力，因此赋予其更好的迁移能力（穿过更窄的通道）（图2a-e）。研究表明，与亲代间充质干细胞相比，货细胞保留了固有的趋化活性、基底膜浸润，并具有更好的变形能力，这可能更好地促进通过体内的小毛细血管、内皮细胞层或间质空间。另外研究人员利用基因工程技术导入hT-MSCs 细胞不表达的外源性趋化因子受体-CXCR4，目前，CXCR4/SDF-1α趋化性迁移通路已被成功应用于临床。研究人员通过慢病毒感染和药物选择，构建了具有CXCR4表达的hT-MSCs（hT-MSC^CXCR4），并制备出表达CXCR4的Cargocytes^CXCR4，实验表明，再给予APC-CXCR4染色后，发现改造后的hT-MSCs^CXCR4以及Cargocytes^CXCR4均能稳定表达CXCR4受体，并且在SDF-1α趋化因子梯度下表现出一定的迁移能力，并且Cargocytes^CXCR4表现出更强的迁移能力（图2f-g）。

图2. 货细胞具有趋化活性并且有更强的迁移能力

要点3. 工程化Cargocytes能与黏附分子特异性结合

除了修饰趋化因子受体外，研究人员将内皮细胞黏附分子（PSGL-1）修饰在hT-MSCs（hT-MSCs^PSGL-1）上，并制备Cargocytes^PSGL-1。流式细胞术显示，Cargocytes^PSGL-1在48小时后依旧稳定表达PSGL-1，并且依旧能够与E/P型选择素结合。在干细胞以及免疫细胞向炎症部位渗透的过程中，内皮黏附分子与选择素特异性结合是“固定”细胞的第一步，此外局部细胞因子诱导的整合素（如VLA-4）的高效激活是血管内皮细胞完全停滞和随后导致外渗所必需的。通过CXCR4-SDF-1α激活的VLA-4是不需要进行基因转录的。研究表明，在基于SDF-1α刺激后，相比于未修饰CXCR4的Cargocytes，修饰后的Caegocytes^CXCR4能够更好地激活VLA-4（图3b-c），此外，研究人员将三种趋化因子受体（CCR2, CXCR4 and PSGL-1/FUT-7）同时修饰到MSC^Tri-E，并优选出最佳的一种修饰后的细胞（(MSC^{Tri-E C19}），并制备得到Cargocytes^{Tri-E C19}，在利用HUVES以及TNF-α构建的体外炎症模型中，发现MSC^Tri-E以及Cargocytes^{Tri-E C19}均具有良好的炎症靶向性（图3d,e）。

图3. 基因工程化修饰的Cargocytes具有与黏附分子相互作用的能力

要点4. 基因工程化修饰的Cargocytes能够主动、特异性靶向至炎症组织-耳朵

研究人员利用耳部炎症模型来考察Cargocytes^{Tri-E C19}（前期研究优选的Cargocytes）炎症部位主动靶向能力。经静脉注入后，首先通过肺毛细血管，再迁移至炎症耳部，因此研究人员通过DiD和RFP双标的MSC以及对应的Cargocyte来追踪其在肺部组织以及耳部聚集程度。此外，研究人员认为3D悬浮培养的MSC较2D贴壁培养的MSC体积大，那么它们所产生的Cargocytes是否也会出现相同的趋势，因此选取2D以及3D培养的MSC以及对应制备的Cargocytes进行肺截留考察，结果显示，3D培养的MSC在肺部的蓄积量明显低于2D培养的MSC细胞，并且与2D培养的MSC所制备的Cargocytes具有近似的蓄积量，说明3D培养的MSC在细胞伸缩性以及刚性等方面与2D-MSC来源的Cargocytes类似，而3D-MSC制备的Cargocytes则具有最低的肺部蓄积量（图4a），这个结果也延伸出某些细胞在3D悬浮培养的时候更接近其在体内的成长状态。如图4b所示，研究人员也研究了修饰以及未修饰MSC及其制备的Cargocytes对炎症部位的归巢效果，研究表明，相对于母细胞（MSC），对应的Cargocytes都具有更强的归巢能力，三组同时比较时，修饰三种趋化因子受体的Cargocytes^{Tri-E C19}显示出最强的归巢能力，相对于炎症耳部（Right ear），未发炎的耳部（Left ear）几乎无分布，类似结果在离体影像结果中也得到验证（图4c，d）。

图4. 基因工程化修饰的Cargocytes能够主动归巢之炎症部位

要点5. Cargocytes能分泌细胞因子以减轻组织炎症和损伤

前期工作已验证外源性导入的GFP-mRNA能够在Cargocytes内表达，因此，研究人员将IL10-mRNA导入MSC以及Cargocytes内，静脉注入后，考察炎症部位IL-10水平以及炎症缓解情况。如图5a所示，相比于对照组（hT-MSC only），IL-10-mRNA修饰的MSC以及Cargocytes的培养基上清在72h内均有稳定持续的IL-10浓度，同时利用相应的培养基上清与巨噬细胞共培养后，他们对应的培养基均能是小鼠骨髓来源巨噬细胞内Stat3磷酸化，说明对小鼠炎症性巨噬细胞具有生物调节活性（图5b）。此外对小鼠炎症耳部的IL-10水平检测、耳部切片以及耳部厚度和相关炎症因子表达情况的考察，得出，IL-10-mRNA修饰的Cargocytes在具有炎症部位归巢能力的同时亦能有效缓解组织炎症及损伤（图5c-f）。

图5. 基因工程修饰Cargocytes能有效地将生物活性IL-10输送到发炎的耳朵并改善局部炎症

要点6. 基因工程修饰Cargocytes有效缓解小鼠蛙皮素诱导的急性胰腺炎

研究人员利用蛙皮素构建小鼠急性胰腺炎模型后，通过静脉注入IL-10-mRNA修饰的Cargocytes^{Tri-E C19}、对应的MSC细胞以及对应来源的外泌体，来考察炎症部位IL-10表达水平，以及相对应细胞因子的转录情况，最终通过切片水平比较得出IL-10- Cargocytes^{Tri-E C19}能够有效缓解蛙皮素诱导的小鼠胰腺炎（图6）。

图6. 基因工程化修饰的Cargocytes^{Tri-E C19}能够有效缓解蛙皮素诱导胰腺炎

总结：

研究人员开发的这种Cargocytes在保留细胞大部分生物功能的同时又具有无细胞载体所表现出的相应特性，在基因工程化修饰后，能主动、高效地靶向炎症部位，其在相应炎症模型所表现出的优势可能为炎症治疗带来革命性的进展。

参考文献：

Wang, H., Alarcón, C.N., Liu, B. et al. Genetically engineered and enucleated human mesenchymal stromal cells for the targeted delivery of therapeutics to diseased tissue. Nat Biomed Eng (2021).

DOI: 10.1038/s41551-021-00815-9

https://doi.org/10.1038/s41551-021-00815-9