细胞质递送，连续两篇Nature Chemistry！
奇物论
能够将外源性货物输送到活细胞中的药物备受追捧，并在细胞生物学中得到广泛应用，而有效的细胞内靶向对于开发新型诊断和治疗药物至关重要。功能性单克隆抗体的细胞内递送将允许利用以前无法成药但与治疗相关的靶标，例如大量的细胞内蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI)。尽管该领域取得了进展，但由于当前载体的毒性或有限的功效，细胞内递送仍然是一项艰巨的挑战。使用病毒和非病毒载体以及电穿孔等物理技术将货物运送到细胞中。每种方法在体外、离体和体内应用的背景下都呈现出明显的优势和劣势。聚阳离子非病毒载体，如聚合物、脂质颗粒和细胞穿透肽 (CPPs)，在过去的三十年中被广泛研究，作为将药物转运到细胞中的一种手段。原型CPP Tat 已广泛用于细胞内靶向治疗的设计。然而，内吞捕获被认为是细胞内递送的障碍。Tat 递送的货物从内体的低水平泄漏通常效率太低，无法适用于大多数细胞内靶向应用。
最近的一些研究试图解决内体捕获的问题。发现与绿色荧光蛋白缀合的环化 Tat (cTat-GFP)和寡精氨酸通过跨细胞膜的直接易位进入细胞质和细胞核。线性寡聚精氨酸被用作一种试剂，通过与质膜的直接相互作用将一系列货物（包括酶、纳米抗体和抗体）输送到细胞中。一种专门设计用于内体分解的 CPP (L17E) 被证明可以促进货物从内体中逸出。在体内转化应用中使用这些方法的一个重要障碍是在体外获得理想结果所需的相对较高的浓度 (>10μM)。重要的是，临床使用的免疫治疗剂（10mg kg-1）的典型剂量导致抗体血浆峰值浓度仅为 2μM 或更低，这强调了对活性约为 1μM 的 CPP 递送技术的需求。
观察到 Tat 和其他 CPP 在内化之前聚集，以及最近对聚阳离子剂的电荷密度与递送功效之间关系的见解，因此，可以假设预先将 Tat 肽排列成多聚体簇确定的化学支架会增加它们的功效。
鉴于此，牛津大学Katherine A. Vallis等人报道了一种使用三聚体细胞穿透肽 (CPP) 将抗体和抗体片段递送到细胞质和细胞核中的方法。成果发表在Nature Chemistry上。
示意图
研究人员报道了基于Tat肽的线性和环状序列的四种Tat三聚体的设计和合成，其排列在两种不同的四聚体核心结构上，其使用活细胞共聚焦显微镜在体外评估。结果表明，合成核心结构的几何形状影响递送的功效，并且用环化变体替换线性Tat改变了摄取机制。
图 | 三聚体 Tat 构建体的合成
研究人员确定了一种三环先导结构(三聚炔烃官能化支架B, tri-cTat B)，并展示了将功能性抗体和抗体片段递送到 HeLa 细胞的胞质溶胶中，这些抗体和抗体片段结合细胞内肌动蛋白原纤维和在活细胞的胞质溶胶和细胞核中表达的荧光蛋白。
图|HeLa 和 CHO 细胞中线性和环状 Tat 三聚体的活细胞共聚焦显微镜
本报告中提供的数据表明，CPP 不是通过单一途径进入细胞质，而是能够结合不同的细胞表面成分，并易于在摄取机制之间切换，以找到进入细胞的最有利的途径。研究结果表明，可以通过改变 Tat 三聚体构象的几何形状来改变摄取机制，同时保持氨基酸序列和净电荷不变。
图|使用 tri-cTat B 在活 HeLa 细胞中共同递送抗体和抗体片段
综上所述，tri-cTat B是一种高效的非病毒递送剂，可将生物大分子货物快速、无毒地转运到细胞中。与病毒递送方法相比，这种方法具有一些重要的优势，病毒递送方法仅限于核酸递送，可以触发宿主免疫反应，而机械递送方法经常导致细胞质内容物丢失，会过度破坏有机分子并使蛋白质变性，并且不太适合体内翻译。使用 β-肌动蛋白抗体和 Fab 片段成功靶向肌动蛋白应力纤维，以及使用 IgG 进行核内 RFP，提高了使用免疫剂对抗细胞质和细胞核内的治疗靶标以影响以前无法药物治疗的疾病相关途径的可能性。总之，tri-cTat B可以作为一种有效的递送剂来解决靶向细胞内治疗靶点的挑战。此外，这里报道的结构-活性见解将有助于开发具有定制机械特性的新型 CPP 多聚体。
值得注意的是，南洋理工大学Ali Miserez等人近日发表在Nature Chemistry上的发现，表明凝聚体微滴可绕过经典的内吞途径，能够直接有效地在细胞溶质中递送各种大分子，从小至 726 Da 的治疗性肽到大至 430 kDa 的酶。（另辟蹊径！截然不同的胞质递送方式，登上Nature Chemistry！）
参考文献：
Tietz,O., Cortezon-Tamarit, F., Chalk, R. et al. Tricyclic cell-penetrating peptidesfor efficient delivery of functional antibodies into cancer cells. Nat. Chem.(2022).
https://doi.org/10.1038/s41557-021-00866-0
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