专稿：均匀SERS基底的开发！

       表面增强拉曼光谱（SERS）是一种高灵敏度、高选择性、无需标记的指纹光谱检测手段，有望取代需要繁琐标记分子的常规荧光检测。然而，基于金属纳米粒子的SERS基底的信号均匀性和稳定性难以满足SERS峰强定量标定检测物的浓度，从而制约了SERS技术的实际应用和商业化。本文从金属纳米粒子SERS基底的增强机理出发，探讨了低成本，高信号均匀性和稳定性的SERS基底的开发，为未来实现SERS基底的商业化打下坚实的基础。

 

大部分基于金属纳米粒子的SERS基底之所以能实现高灵敏度单分子指纹光谱检测，在于金属纳米粒子互相靠近时形成的纳米间隙（nanogap）中的粒子的局域表面等离子共振（Localized Surface Plasmon Resonance）产生耦合，耦合后的电场强度增强达 >10⁸倍，这个纳米间隙又称为SERS基底的热点(hot spot)。理论模拟和实验都证明金属粒子之间的纳米间隙越小，电场增强越大，SERS的灵敏度越高。

 

 

然而，金属粒子SERS基底为了达到高灵敏度（例如检测极限<10^-9 M），必然需要非常小的纳米间隙（< 5 nm），而如此小的纳米间隙使得被检测分子难以均匀吸附在到每个纳米间隙中并被强电场激发，于是导致了在基底的不同检测点上检测到的SERS光谱都不同，这是金属粒子SERS基底难以同时实现高检测灵敏度和高信号可重复性的内在矛盾。至于要大面积制造完全一样的< 5 nm纳米间隙阵列，对目前的纳米制造手段来说仍然是一个巨大的挑战。

 

2008年，Science杂志发表了一篇利用超快激光探测均匀银纳米粒子SERS基底上的拉曼信号可重复性的文章，文章通过实验得出（Table 1）只有数量<1%的分子能够吸附在银纳米粒子形成的高电场（增强因子>10⁷）纳米间隙之中，但是这么小部分的分子发出的SERS信号却占总体的~70%；而>61%数量的分子则没能进入到纳米间隙中，这部分分子发出的SERS信号只占总体信号的4%，也就是说大部分的分子并没有被检测到。这好比社会大部分财富掌握在少部分富人手里，这少部分富人就能影响社会经济的起伏。

 

 

要突破这个纳米间隙带来的SERS信号不稳定，其中一个方法就是用相隔约150 nm的银-硅壳-核纳米柱阵列来取代纳米间隙作为SERS热点。在这种SERS衬底中，20 nm厚的连续银膜覆盖在相隔200nm、直径110nm的均匀硅纳米柱阵列上，在633nm光入射时，纳米柱表面出现沿着纳米柱长度方向的传播型表面等离子体(propagating surface plasmon)驻波，从而产生增强因子约10⁶，衰减长度达50nm的宽电场。由于纳米柱间隔达150nm，被检测分子很容易就能均匀吸附在纳米柱表面上被电场激发了，从而克服了金属纳米粒子纳米间隙热点的不足。

 

 

为了突出纳米柱阵列SERS基底的信号稳定性，作者对比了同样是用均匀银纳米粒子制备的基于纳米间隙的SERS基底 (叫AgFON) 的多点信号：三组分染料分子（R6G, CV, BPE）和50nm长的双链DNA的拉曼信号重复性。实验得出，在扫描了多达4600个数据点中，纳米柱得到非常稳定且可重复的SERS光谱，相对标准差（Relative Standard Deviation）小至7%；而纳米间隙的AgFON衬底得出的SERS光谱则起伏不定，相对标准差达307%！

 

 

如此大的信号重复性差别，除了由于分子能够均匀吸附在纳米柱上之外，还因为纳米柱的电场衰减长度长达50 nm，这样即使50 nm长的双链DNA也能够被纳米柱的电场完全覆盖；相比之下，AgFON的纳米间隙只有几个纳米宽，只能部分涵盖双链DNA的分子链。也就是说，纳米柱在4600个数据点上都是激发整个双链DNA获得信号，而AgFON激发的是DNA的部分分子链以获得信号、且点与点之间激发的分子链也不尽相同。

 

在获得了如此稳定和可重复的SERS光谱的情况下，下一步就是对纳米柱阵列做SERS定量分析，也就是用SERS光谱的峰强标定被检测物的浓度。作者对纳米柱做了双组分染料分子(MG和R6G)和双链DNA单个SERS峰的定量分析。在双组份染料分子定量分析中，表示峰强与组分浓度相关性的相关系数（R²，越接近1相关性越好）高达0.964（R6G）和0.978（MG）；而双链DNA的相关性更高达0.994！多组分定量分析在实际应用中非常重要，因为实际检测中总会存在杂质影响，能从杂质信号中提取被检测物光谱和相应浓度是SERS技术走向商业化的第一步。

 

 

商业化的另一个要求就是低成本大规模制造，对于上述信号均匀纳米柱SERS基底的制备仍然需要在超净间进行多个步骤，制造成本高昂。为降低成本，有不少研究小组都使用自然物料来做SERS衬底，例如纸和玫瑰花瓣。但是，自然物料最大的缺点就是均匀性很差，做出来的SERS衬底得到的信号也非常不均匀，难以实用化。为此，作者从大自然寻找到芋头叶子来制备均匀SERS基底。芋头叶子有着双重结构：微型凸起和二级纳米片，微型凸起使得芋头叶子有超疏水作用，而均匀分布的纳米片则提供了均匀高密度的SERS热点。只需在晒干后的芋头叶子上沉积一层银膜，这种自然SERS衬底就做成了。

 

沉积了银膜的芋头叶子SERS衬底中的双重结构保持不变，微型凸起的超疏水作用能够浓缩分子、起到降低检测限的作用，而交叉纳米片热点则产生增强电场使得SERS信号均匀分布。作者在叶子SERS衬底上演示了R6G分子在>1200个数据点上的相对标准差~9.7%以及检测极限达10^-9M。这种取材于大自然的绿色SERS衬底极大地降低了成本，而信号均匀性也非常高，可望在一次性SERS芯片或手持式SERS仪器上大展拳脚。

 

 

综上所述，均匀SERS基底是SERS技术实用化和迈向商业化的敲门砖。只有基底能提供均匀、可重复、稳定的SERS光谱，利用SERS光谱来提取被检测物的指纹谱和标定其浓度才能成为可能。银-硅纳米柱阵列展示的4600个稳定SERS光谱，可能成为均匀SERS衬底的一个里程碑。

此外，低成本是SERS衬底能够媲美其他检测方式、商业化的另一决定性要素，芋头叶子SERS衬底平衡了高灵敏度和高信号重复性，也为未来SERS技术的商业化发展做了一个很好的榜样。SERS技术的发展和应用除了文字所述的受SERS衬底影响的灵敏性和信号稳定性，还涉及拉曼仪器的影响。SERS技术要商业化，还需要走出实验室，这需要仪器的小型化和平民化，未来的SERS技术发展不可避免地与整合了激光和探测器的芯片实验室（Lab on a chip）微流控系统结合，SERS还有很多精彩的领域和技术有待各位同学去开拓！

 

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1. Huang, et al. SERS-Enabled Lab-on-a-Chip Systems. Advanced Optical Materials, 2015, 3, 618–633.

2. Fang , et al., Measurement of the Distribution of Site Enhancements in Surface-Enhanced Raman Scattering, Science, 2008, 321, 388.

3. Huang et al., Ordered Ag@SiNW  Wide-Range SERS for Reproducible Biomolecule Detection, Nano Lett. 2013, 13, 5039−5045.

4. YQ Zhao, JA Huang et al., Quantitative analysis of multiplex-components and double stranded DNA by wide-range surface-enhanced Raman spectroscopy based on ordered Ag/Si nanowire arrays, J. Mater. Chem. A, 2014, 2, 10218-10224.

5. Huang et al., Superhydrophobic SERS chip based on a Ag coated natural taro-leaf, Nanoscale, 2016, DOI: 10.1039/C6NR03285K