师法自然！多级酶联反应登上Nature Chemistry！
奇物论
2022-06-10
制药行业是一个不断发展的领域，2020年全球市场规模超过1万亿美元，比20年前高出三倍。同样，药物发现、开发和生产的成本也在螺旋式上升，但投资回报率往往较低。此外，在制药行业，公众对更环保和低废物战略的关注和监管压力正在增加。所有这些因素共同推动了创新战略的研究，以创造更便宜、更绿色和更少浪费的制药路线。在这种情况下，生物催化已成为克服这些障碍并实现制药行业可持续发展的一种有吸引力的替代方案。酶级联反应是对环境友好且经济高效的药物合成工艺，因为它们在连续反应中耦合不同的生物转化来合成产品。这些生物催化工具可以解决制药业的两个关键参数：提高合成反应的选择性和通过使用生物相容性催化剂减少潜在危险，生物相容性催化剂可以从生物降解且通常无毒的可持续来源制备。在这里，来自瑞士伯尔尼大学的Francesca Paradisi团队概述了体内（全细胞）或体外（纯化酶）使用的各种酶级联，以专门针对药物相关分子，从简单的构建块到复杂的药物进行讨论。研究人员还通过一系列报道的例子讨论了多步酶级联及其与化学催化剂结合的优点和要求。最后，他们考察了酶级联的效率，以及如何通过酶工程、流动反应器中的过程强化和酶固定化进一步提高它们，以满足所有工业要求。对细胞代谢至关重要的生化反应通常由协调方式工作的酶进行。受大自然的启发，酶级联通过在一个反应锅中组合多个催化步骤来生产广泛的化学产品，为单步反应提供了一种省时、低成本的替代方法。l酶促反应的反应条件通常因其共同的生物来源而更具兼容性,有助于反应步骤之间的过渡；l由于酶的高度特异性，尤其是对其天然底物的特异性，副反应最小。l涉及反应环境：整个细胞（体内）或纯化酶（体外）。1、体内级联反应成本较低，然而，细胞膜可能成为底物或产物通量的屏障，从而阻碍催化反应。此外，产品回收困难、潜在的竞争代谢反应和某些中间体的毒性可能会阻碍体内级联的使用。2、体外级联可以解决大多数问题，尽管酶的纯化会增加整个过程的成本。l酶级联反应也可以根据参与反应的酶的数量进行分类：1、单酶级联依赖于一种显示两种活性的酶将底物转化为产物。2、多酶级联包含两种或两种以上催化不同类型反应的酶，可分为五大类：线性、平行、正交、循环和三角形。天然酶级联通过进化适应了其生物条件，而生物条件通常与工业要求不同。通过基因工程酶或替代催化剂的组合进行人工级联可以克服这些限制。通常，化学酶级联结合使用有机金属络合物和酶。然而，在药物合成的情况下，必须谨慎地选择人工（化学）酶级联。由于药品被指定为供人类食用，对最终产品纯度的要求非常严格，污染物（即试剂和催化剂）必须低于检测水平。多年来，药物构建模块的生产一直是生物催化剂的主要应用之一。药物构建块是用来构建潜在或已知药物的分子片段。所生产的构建模块不仅限于在已知药物的下游合成中使用，它们还使各行业能够通过组合药物发现探索新的化学空间。l用转氨酶合成手性胺：TAs（EC 2.6.1）是一类酶，催化氨基转移到氨基受体，将前手性前体（酮）或醛转化为胺，这是许多药物中普遍存在的基序。这些酶在合成手性胺方面具有主要优势（良好的立体选择性，温和的条件，避免有毒试剂和减少浪费）。O'Reilly等人于2014年报告了通过利用TA（ATA113）和单胺氧化酶（MAO-N）的互补立体选择性，并最终通过硼氢化钠还原，从二酮开始合成手性2,5-二取代吡咯烷。在这一级联反应中，最初的二酮首先被ATA113胺化，生成一种在水中自发环化的中间体，从而使相应的吡咯烷能够被MAO-N去乙酰化。这一酶路线被应用于多种2-甲基5-苯基吡咯烷的合成，这是抗病毒药物（即ombitasvir）和生物碱（即（–）-密码子视碱）中的重要基序。在其他线性级联中，最近报道了Zhang等人在全细胞转氨前还包括三个额外的酶促步骤，这使得苯乙烯烯烃可以转化为对映体纯芳基甘醇，参与生产紫杉醇。l用于合成手性醇的氧化还原酶：氧化还原酶（EC 1）广泛用于合成手性药物构建块。具体而言，重点是使用羰基还原酶（也称为酮还原酶（KRs））或ADHs合成手性醇。这些酶的主要缺点之一是辅因子依赖性。KR和ADH通常需要化学计量的NADH或NADPH才能达到底物的完全转化。或者，可以通过还原与第二种酶（葡萄糖脱氢酶（GDH）、甲酸脱氢酶或亚磷酸酯脱氢酶）进行的氧化偶联，或者，通过添加由相同生物催化剂（乙醇或异丙醇）氧化的牺牲底物，组装酶级联以再循环此类辅因子。Lonza的开创性工作很早就表明了这些酶在工业相关转化中的潜力。实例之一是（R）-乙基4,4,4-三氟-3-羟基丁酸酯（抗抑郁剂倍氟沙酮的构建块）的生产。l展开氧化还原工具：直到最近，氧化还原酶的工业应用实际上仅限于羰基还原酶的使用。随着2011年亚胺还原酶（IRED）的发现及其对映选择性C=N键还原的潜力，情况不再如此。然而，IREDs限制了底物范围和酶的不稳定性是一个挑战。随着对活性位点和催化的进一步了解，蛋白质工程被应用于这类酶以扩大其底物范围。在最近的一个例子中，采用了一种新的IRED标记为HeP5C（长链卤单胞菌的吡咯-5-羧酸还原酶）来制备l-哌啶酸（l-PA），l-哌啶酸是几种抗癌、抗菌和麻醉剂的关键组成部分。HeP5C与嗜热脂肪土杆菌（GsLysDH）的赖氨酸脱氢酶偶联，能够在其ε位置脱氨基l-赖氨酸，形成平行级联。在另一个例子中，Zhang等人筛选了多个IRED，以形成过多的受阻手性2-芳基取代吡咯烷，这是用于治疗抑郁症和焦虑症的k-阿片受体拮抗剂的前体，也可以作为拉罗曲肽等抗癌药物的构建基块。在这种情况下，IRED必须与辅因子回收系统（GDH）耦合。l水中单酰化二胺的合成：辅因子再生的正交法 Lubberink等人最近通过截短羧酸还原酶（CAR）17介导的单酰化合成了不同的酰胺。由于该反应依赖于ATP，这影响了该策略在制备规模上的应用，作者引入了辅助因子循环系统。可以针对1-肉桂酰哌嗪（镇痛分子和血管扩张剂的前体，以及befuraline（1-（1-苯并呋喃-2-基羰基）哌嗪））的生产制备广泛的单乙酰二胺。然而，大多数描述的反应都需要新的策略来实现更高的底物负荷和缩短反应时间，这仍然是实际的限制。当涉及到药物的全合成时，工业需求显然决定了工艺的适用性。为了适用，该过程必须高效，以补偿初始投资的高成本，其特殊性和生产率必须符合市场规模。l在酶单策略中获得对映体苯丙醇胺：苯丙醇胺是安非他明家族的一部分，具有多种应用，既可以作为构建块，也可以作为api直接应用。多年来，人们一直致力于通过简单的反应装置获得这类药物，但对映体产物的合成通常需要基于昂贵的起始材料和中间分离的多步路线。为了克服这些问题，Rother小组提出了两种主要的策略，基于酶级联反应来合成所有四种非(伪)麻黄碱(N(P)E)立体异构体。l原料药合成的水解酶:化学酶法 水解酶(ec3)无疑是工业上应用最广泛的一类酶。脂肪酶因其对映选择性、高活性和耐药以及通过介质选择调节其催化性能的能力而特别受欢迎;例如，它们在水溶液中有利于水解，但在纯有机溶剂中却能达到相反的活性。在化学酶级联反应中，铜(II)双(吡唑基)甲烷配合物与细胞色素P450酶结合，合成双(2-取代的苯并呋喃)衍生物。由于化学反应温度较高（120°C），此级联必须分两步进行，第一步完成后添加酶，但无需纯化中间体，因为酶耐受第一化学催化步骤中使用的共溶剂（二甲基亚砜）。l酶级联产生四氢异喹啉：含有四氢异喹啉（THIQ）的分子具有抗肿瘤、抗寄生虫和神经活性。过去，合成要么通过发酵实现，要么通过典型的化学合成实现，这分别导致产品产量低或涉及多步合成，特异性低。最近，报告了使用纯化酶的三步酶级联反应。首先，利用大肠杆菌的碳连接酶，以丙酮酸和3-羟基苯甲醛为低成本底物。然后，紫罗兰中的TA产生随后的氨基醇。最后，黄丘脑中的去甲月桂碱合酶生成1,3,4-三取代的THIQ。l核苷类似物合成的多步骤酶级联反应：核苷类似物是治疗癌症和病毒性疾病的重要药物。近年来，许多主要基于核苷磷酸化酶（EC 2.4和EC 2.7.7）、脱氧核糖转移酶（EC 2.4.2.6）和脱氧核糖核苷激酶（EC 2.7.1）的酶级联反应被报道用于通过使用天然核苷作为糖供体和修饰的碱基作为糖受体来合成核苷类似物。此外，还描述了通过使用具有四个酶步骤的平行级联合成也具有医药用途的核苷酸，其中辅因子在级联中循环。Merck开发了一个用于合成抗病毒核苷类似物的全酶级联的杰出示例。在这项工作中，从小分子开始，通过五个多酶步骤来制备。级联中使用的五种酶（加上四种辅助酶以循环辅因子并改变不利平衡）经过定向进化，以提高对非天然底物的活性。在工业过程中实施多步骤酶级联在生物催化剂的稳定性、反应条件（即pH、温度和共溶剂）的兼容性以及高底物浓度等方面面临着不可否认的挑战。为了更接近工业需求，可以采取不同的策略来提高酶活性和整个合成过程。图|通过酶级联改进药物合成以实现工业规模集成的策略l过程工程中的新技术：虽然酶促反应在工业规模上取得显著的产量也有其障碍，但几种化学酶方法已经进入制药领域。在最近的一个例子中，诺华报告了在因子XI抑制剂82的合成中使用KR催化步骤。该示例结合了高效合成复杂分子的不同方法，并举例说明了生物催化不仅可以帮助减少获得最终产品所需的步骤数量，而且流动化学和表面活性剂化学可以绕过实施阶段遇到的问题。l通过酶进化满足工业要求：如前所述，氧化还原酶广泛用于手性构建块的合成，但它们往往在所需反应条件下的底物负载或稳定性方面存在缺陷。这些挑战可以通过蛋白质工程和进化来解决。Schober等人最近定制了一种双酶级联反应，将KR和IRED偶联以合成LSD1抑制剂的前体。通过初步筛选，能够确定所需工艺的最佳酶（来自西班牙糖曲菌的KR）。l酶固定化和流动化学：连续工业生物催化 许多将多酶系统共固定在固体载体上的实例都提高了生物催化剂在存在共溶剂的情况下随时间的稳定性，并允许它们集成在流动反应器中。此外，还报道了辅因子和多酶系统的共固定化，并成功整合到连续流动中。在Scott及其同事最近的一项工作中，不同的酶被设计成融合蛋白，以开发由三个域组成的人工生物催化剂，一个催化单元、一个辅助因子回收单元和一个固定化单元。整合不同领域的知识和工具（例如，分子生物学、合成化学、材料化学和工艺开发）对于推动更可持续的药物合成至关重要。事实上，酶级联应用的进展与这些策略的成功息息相关，不仅要在稳定性、活性或特异性方面获得更好的催化剂，而且要产生可扩展和高效的过程。从这个意义上说，固定化酶的使用使我们能够超越酶所表现出的一些主要限制，并允许它们的强化使用。循环生物经济模型的稳步发展需要采用创新方法，利用大自然提供的工具和材料，即师法自然。这也是学术界和工业界都要遵循的一条富有成效的道路。在尊重环境的同时，在开发新技术和产品之间实现平衡的最终目标需要不同学科的整合，生物催化已被证明发挥着关键作用。酶作为生物催化剂，不仅有助于改善工艺的绿色性，而且有助于提高效率。尽管迄今为止已经报道了许多基于酶的反应的例子，甚至已经发展到工业水平，但大多数只涉及一种酶。在这里，讨论了多步骤酶级联的优势，这是一种非常有吸引力的策略，可以开发（复杂）药物的合成路线，避免中间产物的纯化。在制药领域，多步酶级联的应用受到了极大的关注，尤其是因为酶能够产生光学纯手性分子。此外，温和条件的使用，通常与参与级联反应的所有生物催化剂兼容，推动了人们对酶作为催化剂的偏好。许多多步骤酶级联的例子都集中于生产相对较小的分子，作为随后合成药物的基础。然而，研究人员在此总结了其他新兴的研究成果，这些研究突出了药物最终产品中酶级联的潜力，从最简单的分子结构到最复杂的分子结构。这些合成路线是用全细胞或纯化酶进行的，甚至是两者的组合。此外，化学催化步骤已被纳入级联反应中，这导致化学酶策略用于那些不能单独使用酶的合成。然而，在制药工业中全面实施多步骤酶级联仍然必须克服几个挑战。总的来说，生物催化的一个重要障碍是底物负载量仍然很低，这阻碍了生物催化过程的可扩展性。正如islatravir的合成所示，通过定向进化或信息工具指导的酶工程开发改良的酶变体可以在一定程度上缓解这一问题。计算研究的使用也最大限度地增加了发现具有新型催化活性的酶的机会，这为新型酶级联及其与大规模过程的整合打开了一扇广阔的窗口。与实施多步骤酶级联特别相关的是反应条件和底物范围的互补性，以避免与中间产物发生不期望的反应。上述技术可以解决这两个问题（例如，酶工程、酶发现和蛋白质固定化）。最后，多步酶级联在工业过程中的应用需要生物催化剂的高稳定性和高效率。目前已开发出多种固定化多酶级联的技术，可将酶级联集成到流动反应器中，以实现过程强化。这些领域的新进展对于支持酶作为未来化学催化剂的替代品具有极其重要的意义。综上所述，我们仍处于合成药物的多步骤酶级联的初级阶段，但对酶级联的更好理解以及新技术的发展为该领域在可预见的未来蓬勃发展带来了乐观情绪。A.I. Benitez-Mateos, D. Roura Padrosa, F. Paradisi, Multistep enzyme cascades as a route towards green and sustainable pharmaceutical syntheses, Nat Chem, 14 (2022) 489-499.https://www.nature.com/articles/s41557-022-00931-2
