Nature Biomedical Engineering：光遗传学！

奇物论

2022-08-26

背景介绍：

神经科学的一项重大技术进步是用光记录操纵神经活动的能力。神经活动的读取是通过开发基因编码的钙指示物实现的，这些指示物与细胞内钙结合，并发出与神经活动成比例的荧光。光遗传学可以操纵神经活动，利用不同基因表达的光敏离子通道(opins)来激活和灭活特定的神经元群体。总之，这些技术已经彻底改变了神经科学，允许研究人员记录和操纵动物行为的细胞类型特异性的神经活动。最近，钙成像和光遗传学已经能够结合在2光子(2P)显微镜中，同时操纵和成像神经活动。通过这种“全光”的方法，相同的神经元可以同时被记录和刺激，光传输可以限制在单个神经元上。通过使用更真实的生理刺激参数重放钙成像的活动，也可以模拟正常的神经活动。目前，2P显微镜是全光刺激和细胞分辨率记录的金标准。然而，传统的2P显微镜技术有一些关键的局限性，比如成本高、便携性差，使得它难以在自由移动的动物中使用。尽管最近的研究已经开发出了一种便携式2P系统，但仍无法同时结合图形化和钙成像。虽然1光子(1P)模式的刺激和成像系统也已经开发了，但它们也有相当大的局限性，例如需要台式共聚焦显微镜，这限制了系统的可移植性。

基于以上限制因素，来自美国杜克大学的Henry H. Yin团队报告了一种微型单光子内窥镜的设计，用于同时进行光遗传学刺激和钙成像。通过集成数字微镜，内窥镜可以激活视野内的任意神经元，并在成像钙活动时应用任意时空光刺激模式。使用内窥镜对自由运动小鼠的纹状体神经元从直接通路或间接通路成像，同时激活视野中的任何选定神经元。内窥镜还允许根据神经元与特定动物行为的关系选择神经元，并通过光刺激模拟自然神经活动来重建行为，微型内窥镜可能有助于研究神经活动如何引起自由活动动物的行为。

研究思路：

MAPSI的设计：

MAPSI中的钙成像组件基于加州大学洛杉矶分校的微型镜，该微型镜允许对自由移动的动物中的许多神经元进行成像。为了集成发光二极管（LED）激发钙指示剂和激光刺激，研究人员修改了原微型镜设计，以纳入数字微镜装置（DMD）和额外的激光光源。DMD可以创建具有极高空间和时间分辨率的任意光图案。为了同时记录和刺激，研究人员使用了两种光源：第一种是石灰LED（540 nm–580 nm滤光片），用于激发钙指示剂。第二个光源是一个外部激光器（光引擎，PSU-H-LED），它产生蓝光用于光生激发（473 nm）。通过使激发光通过DMD24,26，可以生成图案化光束，该光束与主激发路径中的钙成像激发光合并（图1）。

图|具有全光图案化刺激和成像（mAPSI）的迷你镜

MAPSI的性能测试：

为了测试MAPSI同时刺激和记录自由运动动物神经元的能力，研究人员在背外侧纹状体（DLS）中注射了含有Cre依赖性的jRCaMP1b和ChR2-eYFP的两种病毒载体。jRCaMP1b可以由带有540–580nm激发滤光片的石灰LED激发，并且ChR2可以使用473nm的激发波长和来自单独激光发生器的450-490nm发射滤光器来激活。在D1-Cre和A2A-Cre小鼠中使用Cre依赖性病毒载体并在直接（D1+）和间接（A2A+）途径神经元中表达jRCaMP1b和ChR2-eYFP 28。首先在麻醉小鼠中测试MAPSI，以验证刺激区域与钙成像区域相似（图2a）。研究表明，在大于100 mW mm的高功率下，长时间刺激可能导致不可接受的组织加热。

轴向和横向分辨率：

为了确定MAPSI的轴向（z轴）分辨率，研究人员首先使用共焦显微镜从感染ChR2和RCaMP1jb的D1-Cre小鼠的脑切片记录荧光信号，同时使用MAPSI刺激神经元。轴向分辨率和穿透深度如图2b所示。研究结果发现，刺激小束的全宽半最大值（FWHM）约为30µm。同样的实验也在A2A Cre小鼠的脑切片上进行，结果相似。当激光光斑直径为10µm时，检测到的荧光几乎为圆形，x轴的半高宽为10.5µm，y轴的半宽为9.8µm（图2c）。荧光随着照明区域的直径增加而线性增加，并且随着小光束更深入地穿透组织而强度降低（图2d）。为了确定哪些神经元同时表达ChR2和jRCaMP1b，在低功率（~1mW mm）下连续激发JRCAMP1 B−2 为了获得稳定的基线，ChR2以20Hz（20ms脉冲持续时间，20个脉冲，功率密度~50mW mm）激发−2). 在刺激期间，能够通过靶向测量jRCaMP1b荧光信号的显著增加神经元使用直径为10µm的斑点（图2d）。

图|mAPSI的高分辨率允许图案化刺激和钙成像

在自由活动的小鼠中测试：

MAPSI使得在实验感兴趣的行为期间活跃的单个神经元并回放其活动成为可能。为了模拟自然发生的神经活动模式，研究人员确定了在感兴趣的行为期间活跃的神经元，在D1-Cre小鼠或A2A-Cre鼠中测试了MAPSI，长期植入GRIN透镜（直径1.8 mm，长度4.3 mm），生成了多个10µm小波束进行刺激，同时记录FOV中所有神经元的钙活性。单个DSPN或ISPN可以在不激活相邻神经元的情况下被稳健地和选择性地激活（图3）。偶尔，位于受刺激神经元（图3c中的神经元1）附近的非受刺激的神经元（如图3c的神经元6）几乎系统性地响应，但具有较长的潜伏期（图3d）。这表明一些神经元可以通过电路连接被刺激间接激活。

图|自由行为动物中mAPSI刺激的分辨率

分离行为活跃的神经元并操纵其活动：

为了检验直接途径激活的效果，研究人员将Cre依赖性jRCaMP1b和ChR2-eYFP注射到D1-Cre小鼠中，并将JRCAMP1 b注射到对照小鼠，同时记录它们在开阔场地的行为（图4a）。在DeepLabCut39中标记每个帧后计算转角（图4b，c）。使用头-体向量的导数作为身体姿势角偏差的度量，不论老鼠是否在行走。然后选择15个转向相关神经元（每只小鼠中5个神经元）进行刺激（图4d所示的代表性小鼠）。对这些神经元的选择性刺激引发了与小鼠自然的相当转向（图4g，h，与图4b，e相比较）。令人惊讶的是，刺激5个神经元足以产生反向转向。相反，刺激5个与转向无关的相邻神经元不会产生显著转向（图4g，h）。接下来，研究人员用A2A Cre小鼠进行了相同的实验（图5a）。已知间接通路神经元的激活会产生同向翻转。在354个记录的ISPN中，36个与同向翻转相关。于是选择了12个神经元（每只小鼠视野中的4个神经元），它们在同向旋转过程中表现出强烈的兴奋（N=3只小鼠；图5b，c）。然后，刺激这些转向相关神经元（n=3只小鼠的12个神经元），产生同向转向（图5e，g）。还刺激了在转向过程中不活跃的神经元，这不会产生显著的同向转向。此外，选择性刺激的效果在时间上也是稳定的。

图|激活直接通路神经元的复制反向转向

图|选择性刺激在同向翻转过程中活跃的间接通路神经元可重现同向翻转

合成刺激序列和扫描模式：

为了测试任意刺激模式的效果，研究人员使用两种顺序模式激活转向相关神经元：从外侧到内侧（LM，从最外侧的神经元开始）或从内侧到外侧（ML，从最内侧的神经元开始）（图6b，c）。这两个序列都是反向转向产生的（图6d）。MAPSI还可以产生任意时空光模式来塑造神经活动。对DMD进行编程，以产生覆盖约2%视场的矩形扫描图案。在两个半球的视场上使用了两个不同的方向（ML或LM）（图6f）。在D1-Cre小鼠（N=3）中，两种模式都产生了相反的转向，但不同的扫描方向（ML或LM）之间没有显著差异，而不管半球是否受到刺激（图6g，h）。接下来，使用A2A Cre小鼠进行相同的实验（图7a）。研究人员鉴定了在同向翻转过程中活跃的神经元，并使用与图6（图7b）中使用的相同序列模式。验证了顺序模式刺激期间的钙活性（图7c）。两个序列都产生了同向翻转，LM序列（#1）产生了更大的同向翻转（图7d）。然后，使用图6中使用的扫描模式：在两个半球的视场上进行ML或LM扫描（图7f）。与对照组相比，矩形扫描（ML和LM扫描）显著增加了同向旋转，但不同扫描方向（ML或LM）之间没有显著差异（图7g）。如果在5 s内扫过视野，ML和LM扫描刺激都比对照组产生了更多的转向，并且LM与ML扫描相比产生了更大的转向（图7h）。

图|直接通路的顺序和模式化刺激导致反向转向

图|间接通路的顺序和模式化刺激导致同向性转向

总结与展望：

MAPSI系统具有以下优势与创新：

（1）提供近细胞分辨率刺激（图1和2）；

（2）刺激和记录选定的神经元并同时记录FOV中其他神经元的活动（图3）

（3）识别在特定行为期间活动的神经元，然后选择性地激活相关的神经元群以再现该行为（图4和5）

（4）用刺激重建记录的时空模式；

（5）在FOV中合成任意刺激模式（图6和7）。

在MAPSI中，由于双光束路径相互独立，因此选择用于刺激的神经元可以与FOV中其他神经元的活动同时记录。因此，它允许在自由移动的动物中同时操作和记录任何记录的神经元。因此，MAPSI可用于询问神经元回路功能并研究神经和精神疾病的小鼠模型。简而言之，由于其可移植性和低成本，MAPSI为理解行为的神经基础提供了一个强大的工具。

参考文献：

Zhang, J., Hughes, R.N., Kim, N.et al. A one-photon endoscope for simultaneous patterned optogenetic stimulation and calcium imaging in freely behaving mice. Nat. Biomed. Eng (2022).

https://doi.org/10.1038/s41551-022-00920-3