Nature: 细胞膜伪装纳米系统！

奇物论

2022-12-14

光合作用在绝大多数的人眼中是植物的专属特权，只要简单的享受日光浴就可以实现不吃不喝的壮举。对此权柄的窃取却早就在学术界展开，从单纯的植物走向蓝藻，从宏观的植物细胞走向叶绿体类囊体。从事叶绿体动物细胞移植的科研团队国内也有很多，包括浙江大学与西湖大学等。可惜的是这种跨物种移植需要克服排斥反应，异源性的叶绿体极易被免疫细胞清除。因此，躲避排斥反应是实现哺乳动物体内的天然光合作用系统的一大前提。

对于哺乳动物细胞而言，其能量和还原当量的生成主要依靠于糖酵解与三羧酸（TCA）循环。针对TCA周期的干预措施有望纠正病理条件下ATP供应失调。但合适的TCA循环干涉位点一直未被学界发现，而直接提供外源性ATP对细胞代谢影响不大。NADPH的相关工作也被类似的问题所困扰。因此，构建可控独立的ATP和NADPH自我供应系统以增强细胞合成代谢非常重要。

近日，浙江大学邵逸夫医院骨科与浙江省骨骼肌肉退变与再生修复转化研究重点实验室的范顺武教授、唐睿康教授以及林贤丰博士带领其团队在Nature上发表了一种独立且可控的基于纳米类囊体单元的植物衍生光合作用系统。

该系统可以独立提供关键的能量和还原当量实现细胞合成代谢增强，进而治疗退行性疾病。作者团队使用软骨细胞膜进行伪装封装来突破动植物跨物种困境。这些伪装纳米光合类囊体（CM-NTU）通过膜融合进入软骨细胞，避免溶酶体降解并实现快速渗透。此外，CM-NTU在暴露于光照下原位增加细胞内ATP和NADPH水平，并改善退化软骨细胞的合成代谢。系统地纠正了能量失衡并恢复细胞代谢，以改善软骨稳态并防止骨关节炎的病理进展。

CM-NTU的制备与表征：

首先分析通过挤膜获得的植物类囊体单元（NTU）。NTU粒径约为130 nm，低温透射电子显微镜证实了NTU的纳米结构。蛋白质组学结果表明，NTUs保留了类囊体膜表面光合作用所需的所有蛋白质成分。Gene Ontology 细胞成分分析表明NTU蛋白组分参与NADPH再生和ATP代谢过程。NTU能够在光暴露后催化ADP产生ATP。分离测量了NTU中D1和D2蛋白随时间推移的丰度。在光照下，D1和D2蛋白均在8-16小时内完全降解。在黑暗条件下，两种蛋白质在5-7天内完全降解。然后测量NTU的ATP生产能力随时间的变化。在光照16小时或在黑暗中储存7天后，NTU产生ATP的能力显着降低。总体而言，NTUs在光照和黑暗条件下产生ATP的能力变化与蛋白质降解水平的变化一致。

接下来，作者团队纯化并获得了软骨细胞膜（CM）样品，并对其进行了蛋白质组学分析。分析表明蛋白质成分主要与细胞膜的结构有关。蛋白质印迹分析的结果进一步验证了CM的成功分离。将纯化的CM和NTU一起物理挤出以获得CM-NTU。尺寸约216 nm和表面zeta电位数据均表明NTUs成功被细胞膜包被。通过冷冻透射电镜和透射电子显微镜（TEM）可视化样品证实了CM-NTU的核壳结构。

图 CM-NTU的制备和表征

评估CM-NTU的细胞摄取：

为了研究NTU的体内代谢情况，将小鼠巨噬细胞或软骨细胞与NTU，LNP-NTU或CM-NTU一起孵育。巨噬细胞中的NTUs或LNP-NTUs的荧光强度大于CM-NTUs。这一结果表明，CM包被显着减少了NTU和巨噬细胞之间的相互作用。与NTU或LNP-NTU相比，CM-NTUs被软骨细胞更有效地内化。这些结果表明了CM-NTU的选择性靶向能力。

然后，研究CM-NTU的细胞内运输特性。CM主要积聚在细胞外层，而NTU集中在内部。因此提出CM-NTUs的整合途径可能类似于包膜病毒的整合途径，其通过膜融合启动细胞内化，然后将封闭的衣壳释放到细胞质中。流式细胞术分析显示，虽然低温抑制了CM-NTUs的细胞摄取，但添加内吞相关抑制剂没有影响。这些发现表明，CM-NTU可能主要通过膜融合机制进入软骨细胞。继续研究CM-NTU的选择性。将CM-NTU添加到五种不同细胞类型。结果表明，与其他细胞相比，软骨细胞特异性地吸收CM-NTU。与涂有其他膜的NTU相比，软骨细胞吸收CM-NTU的百分比最高。大多数通过细胞内吞作用内化的异物被进一步运送到溶酶体中，然后在溶酶体中降解。在这项研究中，只有少数内化CM-NTU的信号与溶酶体共定位。

图 CM-NTU的细胞膜融合和细胞内释放过程

CM-NTU改善细胞合成代谢：

鉴于CM-NTUs的成功制造，评估其对细胞合成代谢的光控作用。选择IL-1β诱导小鼠软骨细胞代谢损伤。暴露在红光下的CM-NTU照射30分钟，并用25μM封装的铁氧还蛋白用于后续实验。在这些条件下，CM-NTU恢复了损伤软骨细胞中ATP和NADPH水平。此外，CM-NTUs在没有IL-1β处理的情况下也可以增强软骨细胞中ATP和NADPH的产生。光照/CM-NTUs处理的细胞中ATP和NADPH水平逐渐升高，在1-2小时达到峰值，然后由于细胞内ADP和NADP耗尽而趋于稳定。8小时后，ATP和NADPH水平开始下降。到32小时，ATP和NADPH水平与在非照明细胞中观察到的水平相似。在非照明细胞中，CM-NTU对细胞ATP水平没有影响。

将IL-1β处理的软骨细胞与CM-NTU一起孵育，有或没有光照射，并跟踪软骨细胞的变化。用CM-NTUs和光照射处理显着增加了ECM合成相关蛋白的水平，并降低了ECM降解相关蛋白的水平。相比之下，在黑暗中CM和CM-NTU对软骨细胞的蛋白质水平没有影响。使用CM-NTUs和光照射治疗后，注意到残留软骨增加。

验证CM-NTUs对IL-1β诱导的线粒体活性失调的影响。与黑暗/CM或CM-NTUs处理的软骨细胞相比，光照/CM-NTUs处理的软骨细胞中观察到线粒体相关的ROS水平显着降低。光照/CM-NTUs处理后，线粒体膜电位探针JC-1检测到的红色荧光显著增加，表明能量状态增强。同时软骨细胞的SIRT-1，PGC-1α，TFAM，NRF1和NRF2水平升高，而这些蛋白水平的高水平表达与线粒体良好的能量代谢状态有关。此外，IL-1β刺激后，软骨细胞中的细胞质ATP/ADP比值从2.42下降到0.84。CM-NTUs的加入使细胞质ATP/ADP的比率恢复到2.39，这表明细胞内能量状态恢复。这些结果表明，CM-NTUs可以通过光可控的天然光合作用系统改善细胞合成代谢。

图 CM-NTU改善细胞合成代谢

CM-NTU重新编程细胞代谢：

有研究报道，ATP和NADPH的产生可能导致细胞代谢增强。进行转录组学分析，以全面确定细胞合成代谢的变化。炎症刺激可能通过增加糖酵解和减少氧化磷酸化来增强软骨细胞的代谢重编程，IL-1β组显示参与糖酵解的基因表达上调，参与氧化磷酸化的基因表达下调。IL-1β加CM-NTU组表现出参与TCA循环和氧化磷酸化的基因的上调表达，以及参与糖酵解和ECM降解的基因的下调表达。代谢组学分析表明IL-1β加CM-NTU组对细胞TCA循环、呼吸电子传递、糖酵解和胶原蛋白合成有显著影响。

整合转录组学和代谢组学分析细胞能量和物质代谢，发现CM-NTUs增加了两种胶原蛋白合成机制中的代谢物丰度和基因表达，这有利于软骨ECM的再生。此外，参与糖胺多糖合成关键底物的N-乙酰基-D-葡萄糖胺的水平和参与相关基因的表达水平升高。总之，CM-NTU驱动的代谢重编程可以纠正退化软骨细胞中能量和物质代谢不平衡。

图 CM-NTU促进细胞代谢重编程

CM-NTU对骨关节炎的治疗：

对于动物模型，作者团队研究了关节内注射CM-NTUs并光照是否可以抑制小鼠前交叉韧带横断（ACLT）诱导的骨关节炎的进展。光照/CM-NTU处理在术后8周和12周显着减弱软骨破坏。国际骨关节炎研究学会（OARSI）的分数进一步证实了这一结果。接受光照/CM-NTUs治疗的膝关节表现出较少的骨关节炎变化，切片也上显示Col II和聚集聚糖含量增加。治疗组的术后12周表现出软骨下骨板的形态改变和骨赘形成减少，抑制了胫骨软骨下骨重塑，减少组织总体积和骨小梁模式因子。

对关节软骨的ATP和NADPH浓度分析，光照/CM-NTUs治疗增加了ATP和NADPH的产生。ACLT术后，关节软骨中ROS的荧光强度增加，而光照/CM-NTUs治疗逆转该ROS的产生。炎症层面，降低了诱导性一氧化氮合酶的蛋白质水平。光照/CM-NTUs治疗也减少了ACLT诱导的骨关节炎疼痛。综上所述，这项研究表明，CM-NTUs可以促进软骨稳态并防止动物的骨关节炎进展。

图 CM-NTU治疗对小鼠骨关节炎的体内影响

小结：

作者团队利用膜包被策略，证明了植物来源的天然光合系统跨物种移植的可行性和适用性。这种治疗策略是可推广的，因为来自不同成熟哺乳动物细胞来源的涂层均可用应用于该体系并为各种退行性疾病提供治疗的可能，这使得该平台体系拥有极佳的临床应用潜力。

此外，作者团队构建了一个自然光合作用系统，该系统在光照下实现了独立促进细胞中关键能量和代谢载体的供应，同时可以克服排斥反应的限制。Nature的资深编辑George Caputa表示如何向细胞输送能量一直是困扰细胞生物学的难题，并且实现特定代谢物含量的正确补给是临床治疗的持久性难题。该研究对此困境给出了一份令人信服的答案，也为利用天然材料精确调控新陈代谢提供了新方法。这种光合作用系统可以增强细胞合成代谢，在治疗退行性疾病方面表现出有希望的临床潜力。

参考文献：

Pengfei Chen, Xin Liu , Chenhui Gu, et al. A plant-derived natural photosynthetic system for improving cell anabolism. Nature. 2022 Dec 7.

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05499-y#Sec7