碳纳米管，再登Nature Nanotechnology！

奇物论

2023-04-12

碳纳米管 (CNT) 在电子、材料科学、生物学和医学等多个领域的应用引起了人们的极大兴趣。然而，由于它们可能具有毒性和在自然界中的持久性，国际化学秘书处 (ChemSec) 最近将 CNT 添加到 SIN（“立即替代”）化学品清单中，建议在未进行人体健康风险评估的情况下不应使用 CNT。因此，需要额外的努力来了解CNT与可能诱发炎症和控制毒性的人类分子之间的相互作用。这些知识对于设计和开发更安全的 CNT 至关重要。

先前的报告表明，长而硬的多壁碳纳米管 (MWCNT) 在啮齿动物中具有类似石棉的致病性。与石棉一样，在腹腔注射后，多壁碳纳米管优先被巨噬细胞吞噬，随后的巨噬细胞炎症反应被认为会引起慢性炎症，从而导致间皮瘤。事实上，体外研究表明，MWCNT 和石棉都会立即被巨噬细胞吞噬并诱导细胞焦亡和 Nlrp3 炎性体激活，从而导致白细胞介素 1β (IL-1β) 分泌。然而，人们对巨噬细胞如何识别其细胞表面的多壁碳纳米管知之甚少。

近日，研究人员将 T 细胞粘蛋白免疫球蛋白 (Ig) 4 (Tim4) 和 Tim1 磷脂酰丝氨酸受体鉴定为小鼠中的CNT识别受体。这些受体的独特之处在于它们在其顶端位置具有一簇芳香族残基，有助于直接识别 CNT。值得注意的是，通过抗Tim4单克隆抗体 (mAb) 掩蔽Tim4或Tim4基因缺失可改善CNT诱导的腹膜炎症和肉芽肿形成，突出了巨噬细胞吞噬 CNT 在其毒性中的关键作用。然而，在人类中，尚不清楚 Tim4 是否参与此过程，因为 Tim4 mRNA 水平在人外周血单核细胞 (PBMC) 和肺组织中处于边缘状态。

之前，研究人员使用了长而硬的多壁碳纳米管（132 ± 47 nm× 5.1 ± 2.4 μm）对其进行了详细表征，并观察到人外周血（PB）单核细胞有效地吞噬了这些MWCNT，然后分泌IL-1β， 尽管 Tim4 和Tim1 都不在其细胞表面表达。因此，这表明存在未知的人类 CNT 识别受体。 鉴于 Tim4 和 Tim1 的独特结构，其顶端包含一簇芳香残基，研究人员假设这样的簇对于 CNT 识别至关重要。因此，在目前的工作中，立命馆大学Masafumi Nakayama、日本烟草公司Kota Kasahara等研究人员主要是寻找含有芳香簇的Tim4样受体。

计算机筛选和 AlphaFold 建模将Siglec-5 和 Siglec-14 识别为 CNT 结合受体

研究人员进行了基于三维蛋白质结构的计算机筛选。通过蛋白质数据库(PDB)和 GO分析，以及视觉筛选，以识别在其顶端位置含有此类簇的 Tim4 样受体，并最终分离出唾液酸 Ig 样结合凝集素 (Siglec)-5 和 Siglec-3。

尽管已知 Siglec 受体可以识别各种含唾液酸的聚糖并在免疫细胞信号传导中发挥关键作用，但它们是否识别 CNT 仍然未知。因此，研究人员用人 Siglec-5 或 Siglec-3 重建了 NIH-3T3 细胞。引人注目的是，Siglec-5而非Siglec-3 的表达使 NIH-3T3 细胞能够识别 MWCNT。此外，Siglec-5/NIH-3T3 细胞的 MWCNT 结合活性高于Tim4/NIH-3T3 细胞。

图|将 Siglec-5 鉴定为 CNT 识别受体

研究人员并使用MD模拟和体外结合试验来解析其结合过程。研究人员调查了两个 Siglec-5 突变体 WY50/51AA 和 WYYY50/51/68/69AAA，以检查这些芳香簇对结合的重要性。结果表明，这两种芳族簇加起来有助于识别 CNT 表面，并且它们的损失会导致结合的显著不稳定。因此，这突出了一种由多种芳香-芳香相互作用介导的新型纳米-生物界面。

图|MD 模拟和体外验证以阐明 Siglec-5 与 MWCNT 的结合模式

研究人员还探索了其他 Siglec 是否也能识别 CNT。研究发现，Siglec-14 的 V 组 Ig 样结构域与 Siglec-5 具有 100% 的氨基酸同一性，不出所料，Siglec-14 和 Siglec-5 的表达使细胞能够识别 MWCNT。

图|Siglec-14，而不是 Siglec-5，吞噬多壁碳纳米管以诱导 IL-1β 分泌和肺部炎症

Siglec-14 介导 MWCNT 的吞噬作用并引发炎症

值得注意的是，Siglec-14 通过带有基于酪氨酸的激活基序 (ITAM) 的 DAP12 传递激活信号，因此 Siglec-14 可能参与 MWCNT 诱导的炎症。相反，Siglec-5 在细胞质结构域中具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序 (ITIM)，因此可以抑制炎症。为了解决这些配对受体的功能，研究人员构建了 THP-1细胞，一种稳定表达 Siglec-5 或 Siglec-14 的人单核细胞系。有趣的是，Siglec-14 被发现介导 NF-κB 激活，如 IκB-α 的瞬时降解所示，并诱导 IL-8 分泌以响应 MWCNT。另一方面，Siglec-5 对这些促炎反应没有显着影响。总之，这些结果表明 Siglec-14 响应于 MWCNT 传递炎症信号。值得注意的是，Siglec-14 蛋白被 MWCNT 下调，而 Siglec-5 蛋白的表达没有变化。考虑到细胞表面 Siglec-14 的快速下调，该受体可能被内化和降解。实际上，尽管在 MWCNT 识别方面，Siglec-5 和 Siglec-14 之间没有显着差异，但 Siglec-14 显著诱导了 MWCNT 的吞没，而 Siglec-5 仅结合 MWCNT。

为了解决 Siglec-14 的体内作用，研究人员通过使用慢病毒转导系统生成了在约 30% 的 Siglec-F⁺ 肺泡巨噬细胞上稳定表达 Siglec-14 的小鼠。当这些小鼠气管内 (i.t.) 注射多壁碳纳米管时，Siglec-14转导的巨噬细胞在体内比未转导的巨噬细胞更有效地识别多壁碳纳米管。注射后第 1 天，与模拟转导小鼠相比，Siglec-14 转导小鼠的支气管肺泡灌洗液 (BALF) 中的 IL-1β显著增加。与此一致，肺组织的H&E染色显示在 Siglec-14 转导小鼠的肺泡腔中有炎症细胞积聚。总之，这些结果表明 Siglec-14 介导肺部炎症以响应 MWCNT。

图|Siglec-14 介导的人单核细胞对多壁碳纳米管的识别

Syk抑制剂福他替尼减弱Siglec-14 介导的对多壁碳纳米管的炎症反应

鉴于脾脏酪氨酸激酶 (Syk) 可能参与 Siglec-14-DAP12 信号传导，研究人员使用 CRISPR/Cas9 系统生成了 Syk 无效细胞。Syk缺失不影响 Siglec-14 的细胞表面表达，但会显著降低 MWCNT 的吞噬作用和随后的 IL-1β 分泌，表明 Syk 信号传导的重要作用。这一发现促使研究人员解决 Syk 是否可以成为治疗目标的问题。正如所料，R406 是 FDA 批准的 Syk 抑制剂福他替尼 R788 的活性代谢物，它以剂量依赖的方式显著阻断 S14^+/-供体 PBMC 以及 Siglec-14/THP-1 细胞分泌 IL-1β。另一方面，R406 不影响尼日利亚菌素或 ATP 诱导的 IL-1β 分泌，排除了非特异性毒性作用的可能性。此外，口服 R788 可显著降低 MWCNT 诱导的 Siglec-14 转导小鼠 BALF 中 IL-1β 和 TNF-α 的分泌。这些数据表明，福他替尼在体外和体内抑制 Siglec-14 介导的对多壁碳纳米管的炎症反应。

Siglec-14-Syk 介导的对多壁碳纳米管的炎症反应被福他替尼阻断

多壁碳纳米管与单壁碳纳米管的毒性差异

与多壁碳纳米管相比，单壁 (SW) 碳纳米管被认为毒性较低。因此，作者还评估了单壁碳纳米管的生物学效应。WCNT连接 Siglec-14 以诱导 IL-8 分泌，但内化的 SWCNT 不会引起溶酶体损伤和相关的 IL-1β 分泌。另一方面，据报道，单壁碳纳米管会导致线粒体损伤。因此，细胞内事件而非细胞表面识别可以解释 MWCNT 和 SWCNT 之间的毒性差异。

小结

综上所述，研究人员证明 Siglec-14 通过细胞外芳香簇识别 CNT，从而引发炎症。值得注意的是，据报道碳纳米材料通过芳香-芳香相互作用结合可溶性蛋白质的芳香基团，其方式与 Siglec-5/14-CNT 相互作用相同。因此，Siglec-14 可能与蛋白冠的芳香基团竞争或结合，以分别直接或间接识别 CNT。因此，这项研究强调了芳香簇在 Siglec 分子的受体细胞外环中对 CNT 识别的重要性。

CNT是具有广泛潜在应用的创新工具，大多数人可能会对它们产生反应。Anti-Siglec-14 mAb 和福他替尼可能是控制 CNT 毒性的治疗和预防工具。

参考文献：

Yamaguchi, SI., Xie, Q., Ito, F. et al. Carbon nanotube recognition by human Siglec-14 provokes inflammation. Nat. Nanotechnol. (2023). 

https://doi.org/10.1038/s41565-023-01363-w