国家纳米中心, Nature Nanotechnology!

小奇

2023-12-13

作为一种肿瘤免疫疗法，肿瘤疫苗接种唤起对突变产生的肿瘤抗原具有特异性的T细胞，以实现对肿瘤细胞的免疫识别和消除。在这个过程中，抗原呈递细胞（APC）向T细胞的有效抗原呈递是一个基本特征。目前提高肿瘤疫苗接种效力的方法集中在疫苗配方上，包括使用免疫佐剂促进APC的成熟，以及使用纳米载体提高APC中的抗原处理效率。作为先天免疫细胞，APC本身的效力通常被认为是一致的，不会影响健康人的疫苗效力。然而，越来越多的证据表明，在不同的情况下，先天免疫细胞的效力是可变的，在不同情况下，这些细胞对免疫反应和免疫疗法具有高度影响。先天免疫细胞的长期功能重编程发生在遇到初级免疫刺激后。即使在不同的刺激下，这种改变也会增加后续刺激的反应效力。先天免疫细胞的这种记忆样能力被称为“训练免疫”。经过训练的免疫是由骨髓中造血祖细胞的表观遗传学改变驱动的，因此，在诱导经过训练的免疫力后，先天免疫细胞的高效力状态通过具有记忆样表型的外周先天免疫细胞持续分化和产生而持续数月。可以假设，诱导经过训练的免疫力是提高肿瘤疫苗接种效果的一种很有前途的策略。

某些促炎刺激物，如 β-葡聚糖、卡介苗 (BCG) 疫苗、氧化低密度脂蛋白和尿酸，已被确定为经过训练的免疫诱导剂。这些刺激对造血祖细胞的影响是间接的，其中白细胞介素-1 (IL-1) 细胞因子家族，尤其是 IL-1β，是主要的中介物。一些经过训练的免疫诱导剂可以通过激活体内炎症小体信号通路引起IL-1β分泌，最终导致骨髓中造血祖细胞的表观遗传重塑和谱系转变。大多数炎性体传感器，例如包含蛋白 3 (NLRP3) 的Nod样受体(NLR) 家族 pryin 结构域 (PYD)、包含蛋白 4 (NLRC4) 的 NLR 家族C 末端 caspase 招募结构域 (CARD) 和 caspase-11，都是位于细胞质中。与自由刺激相比，纳米结构刺激由于其更容易进入细胞内吞作用和多重激活特性，可能会诱导更强的炎症小体信号通路激活和IL-1β分泌，从而产生更强大的训练免疫力。

外膜囊泡（OMV）是源自革兰氏阴性细菌的天然纳米囊泡。由于存在多种病原体相关分子模式（PAMP），例如肽聚糖、脂多糖（LPS）和鞭毛蛋白，纳米囊泡具有激活先天免疫信号通路的强大能力。OMV已被认为是疫苗佐剂和载体。尽管 OMV 被哺乳动物细胞内吞，并将 LPS 递送到胞浆中以触发 caspase-11 炎症小体，但 OMV 对训练后的免疫力的潜在刺激作用仍未被探索。

鉴于此，国家纳米科学中心聂广军、赵潇等研究人员利用含有大量病原体相关分子模式的细菌源性外膜囊泡进行预疫苗接种，可以通过训练有素的免疫力来增强和增强肿瘤疫苗接种。

该研究利用了大肠杆菌来源的外膜囊泡（OMV），通过显微镜和纯化技术进行了表征。OMV 批次之间一致的形态和蛋白质组成验证了提取方法。腹腔注射 OMV（150μg）证明了免疫刺激和安全给药。OMV 注射后 7 天，免疫系统状态恢复到基线。预先施用 OMV 显着增强了抗原呈递细胞对后续肿瘤疫苗接种的反应，扩大了外周免疫器官。观察到树突状细胞和巨噬细胞增加，以及成熟和抗原呈递标记物增加。

图|预用OMVs加强肿瘤疫苗接种

对 OMV 训练小鼠肿瘤疫苗接种后淋巴结中的树突状细胞 (DC) 和巨噬细胞 (Mφ) 进行转录组测序，结果显示 DC 中有 283 个差异表达基因，Mφ中有665 个差异表达基因。在 DC 中，256 个转录本上调，27 个转录本下调；在 Mφ 中，496个转录本上调，169 个转录本下调。基因本体（GO）富集分析强调了免疫相关途径，包括补体激活、体液免疫反应、对细菌的防御反应、适应性免疫反应和抗原结合。OMV 训练小鼠中上调的基因包括与先天免疫激活（Calr3、Rfx5、Psme2b、Atg7、Lamp1、H2-D1、H2-K1）、共刺激（CD80、CD86）、细胞因子（IL6、IFNG、IL1β）相关的基因 DC 和 Mφ 中的 Cxcl10、C3、Tnfaip3）和趋化因子（Icam1、Ccr9、Ccl25、Zap70）。这些发现表明，OMV 给药广泛增强了小鼠对后续肿瘤疫苗接种的先天免疫反应。

该研究深入探讨了OMV对祖细胞水平的先天免疫和表观遗传重塑的影响。转录组测序揭示了 OMV 训练小鼠肿瘤疫苗接种后树突状细胞 (DC) 和巨噬细胞 (Mφs) 中基因表达的差异。骨髓分析显示造血祖细胞亚群发生变化，多能祖细胞 (MPP) 和偏向骨髓的 MPP3 亚群增加。在 OMV 训练的小鼠中，骨髓祖细胞 (MyPs) 和粒细胞巨噬细胞祖细胞 (GMPs) 增加，而共同骨髓祖细胞 (CMPs) 减少。研究结果表明，OMV 不仅促进骨髓分化，而且还在祖细胞中印记表观遗传变化，从而在随后的肿瘤疫苗接种过程中，在训练有素的抗原呈递细胞 (APC) 中有效转录免疫相关基因。

图|预先施用OMVs诱导肿瘤疫苗接种后DC的转录组改变，并导致造血祖细胞的谱系转变和表观遗传学重塑

腹腔注射后 OMV 的体内行为显示先天免疫细胞快速摄取，无需直接进入骨髓。OMV预给药后，炎症细胞因子（尤其是IL-1β）的血清水平显著升高，骨髓细胞外液也相应升高。IL-1β是公认的训练免疫诱导剂，使用IL-1受体拮抗剂（IL-1RA）和中和抗体的实验表明，当IL-1β信号传导被阻断时，OMV诱导的造血祖细胞变化，包括骨髓分化偏向，被逆转。在 OMV 训练的小鼠中，阻断 IL-1 受体会阻碍树突状细胞和巨噬细胞对随后的肿瘤疫苗接种的反应增强，从而导致与对照小鼠中观察到的类似的抗原特异性 T 细胞反应。这些发现强调了 IL-1β 作为 OMV 诱导的骨髓生成变化介质的关键作用，以及在随后的肿瘤疫苗接种过程中训练的免疫效应。

图|OMVs通过刺激IL-1β分泌诱导骨髓生成改变

IL-1β的产生涉及两个步骤：IL-1β 转录上调的“启动步骤”和导致 caspase-1 成熟和 IL-1β 分泌的“激活步骤”。用 OMV 处理的骨髓来源细胞的体外实验显示出显著的 IL-1β 产生，表明 NLRP3 炎性体激活。抑制NLRP3或caspase-1可减少OMV诱导的IL-1β 分泌。探索了NLRP3炎性体激活在增强 OMV 预给药后后续肿瘤疫苗接种反应性中的作用。OMV 治疗的小鼠表现出增强的免疫反应，但抑制炎性体激活显著降低了这些效应，影响了脾细胞中的 APC、短寿命效应细胞、记忆前体效应细胞和抗原特异性 T 细胞。这表明OMV对后续肿瘤疫苗接种诱导的训练免疫效应主要是通过炎性体信号通路介导的。

图|OMVs通过NLRP3炎症小体信号传导诱导IL-1β的产生

OMV 表面的脂多糖 (LPS) 激活caspase-11相关的非典型炎症小体，导致K⁺流出和典型 NLRP3 炎症小体激活。OMV 有效地将 LPS 传递到 BMDC 和 BMDM的胞质中，触发 caspase-11 成熟和 IL-1β 产生。OMV 内吞作用的化学抑制可减少 IL-1β 的分泌，证实了 OMV 作为 LPS 递送纳米颗粒载体的作用。比较 OMV 和游离 LPS 预给药对后续肿瘤疫苗接种的影响，只有 OMV 训练才能增强APC 和 T 细胞反应，突出了 OMV 在细胞内递送 LPS 方面的重要性。caspase-11 敲除小鼠中缺乏疫苗增强作用进一步支持了这种差异，强调了 OMV 刺激 caspase-11 依赖性 IL-1β 产生和经过训练的免疫介导的疫苗增强的独特能力。

图|OMVs通过将LPS递送到胞质溶胶中来激活炎症小体信号传导

在肺转移性B16-OVA和皮下 MC38 肿瘤模型中，预先施用OMV显著提高了后续肿瘤疫苗接种的治疗效果。接受 OMV 训练的小鼠在接种疫苗后表现出更高的抗原特异性 T 细胞活化、分离的脾细胞更强的细胞毒性作用以及增加的肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞。对健康小鼠免疫记忆的评估显示，经过 OMV 训练的小鼠中效应 T 细胞和中枢记忆 T 细胞明显增多，从而增强了对肿瘤挑战的长期抵抗力，减缓了肿瘤生长并延长了生存期。该研究表明，OMV 可以激活经过训练的免疫力，从而改善抗肿瘤反应和长期保护作用，突显 OMV 作为增强肿瘤疫苗接种的独特免疫动员策略的潜力。

图|基于OMV诱导的训练免疫增强肿瘤疫苗接种的免疫动员示意图

总之，研究人员报告了在肿瘤疫苗接种前一周向小鼠腹腔注射细菌 OMV 可显着增强抗肿瘤免疫力，其中 OMV 诱导的训练免疫力是其因果机制。由于其天然的纳米结构，OMV被腹膜内先天免疫细胞内吞，同时将PAMP（特别是LPS）输送到细胞质中，从而激活炎症小体信号通路，诱导IL-1β分泌。IL-1β进入骨髓导致造血祖细胞的谱系转变和表观遗传学重塑，最终使分化的外周APC对随后的肿瘤疫苗接种表现出增强的反应性。这种免疫动员策略使用源自细菌的天然纳米囊泡来改变基本的先天免疫功能，是积极引导疫苗诱导的适应性免疫反应的一种很有前途的方法。

参考文献：

Liu, G., Ma, N., Cheng, K. et al. Bacteria-derived nanovesicles enhance tumour vaccination by trained immunity. Nat. Nanotechnol. (2023). 

https://doi.org/10.1038/s41565-023-01553-6