他，2篇Science后，再发Nature Nanotechnology，这次转向纳米笼！

小奇

2024-05-10

现有的疫苗接种策略已成功减少 SARS-CoV-2 (SARS2) 造成的死亡和严重疾病。然而，疫苗保护作用的减弱、新变种的不断出现以及治疗效果的不确定意味着仍然迫切需要新的疫苗策略。防范冠状病毒带来的新的大流行威胁也很重要，冠状病毒此前曾导致 SARS-CoV (SARS1) 和 MERS-CoV的爆发。其他人畜共患冠状病毒如 WIV1 和 SHC014 已被确定具有大流行潜力。使用单一抗原进行免疫通常会诱导狭窄的菌株特异性免疫反应，这可能无法抵御多种先前存在的菌株或该病原体新出现的变种。

在最近的研究中，VLP在其表面上展示一组随机排列的蛋白质变体，以驱动B细胞的扩增，识别不同抗原的共同特征。铁蛋白纳米颗粒上不同血凝素头的镶嵌体引发了针对H1亚型内不同流感病毒株的交叉反应抗体。这种方法已应用于SARS2，镶嵌纳米粒子展示来自不同 sarbecovirus 的刺突的多个受体结合域（RBD）。Sarbecoviruses 是 beta 冠状病毒的亚属，包括 SARS1 和 SARS2。RBD可以通过基因融合或异肽偶联在VLP上多聚化。一组 sarbecovirus RBD 与 SpyTag003 的融合有助于在 SpyCatcher003-mi3 VLP12 上进行简单的纳米组装（图 1a）。SpyCatcher003 是研究人员设计的一种蛋白质，可与 SpyTag 肽快速形成异肽键。mi3 是一种 60 聚体的中空蛋白质纳米笼，经过计算设计可自组装成稳定的十二面体。

先前，加州理工学院Pamela J. Bjorkman等人前后在2篇Science上表明，最广泛的免疫反应来自显示八种不同 RBD 的镶嵌颗粒。这些 Mosaic-8 纳米颗粒在小鼠和恒河猴模型中引发了针对多种sarbecovirus的中和抗体。重要的是，反应并不限于RBD表现在Mosaic-8纳米颗粒上的病毒，还包括针对异源sarbeco病毒的不匹配反应。Mosaic-8纳米粒子已获得流行病防范创新联盟的支持进入临床试验。然而，需要在良好制造规范级别生产九种不同的组件（八种 RBD 和 SpyCatcher003-mi3），这给广泛扩展带来了挑战。

成果简介

鉴于此，Pamela J. Bjorkman联合牛津大学Mark R. Howarth和Alain R. Townsend等研究人员建立了多病毒四重纳米笼（Quartet Nanocages）的生产（图1a）。最初，研究人员用四种不同病毒的 RBD 表达多病毒四重体，连接成一条多肽链。这些抗原四重体通过终端 SpyTag 组装，从 SpyCatcher003-mi3 纳米笼中延伸出来，形成具有分支形态的蛋白质纳米颗粒。这种纳米组装路线减少了疫苗成分的数量，并创建了一种允许在每个纳米笼上展示更多数量的 RBD 的架构。抗体诱导的规模和广度表明，Quartet 纳米笼 可以提供一种可扩展的途径来诱导一系列相关病毒的中和抗体，为新出现的疾病爆发威胁做好准备。

多病毒Quartet纳米笼的设计

SARS-CoV-2的RBD是病毒与人体细胞表面血管紧张素转换酶2（ACE2）结合的关键部分，也是大多数中和抗体的作用目标。研究者将四种与SARS-CoV-2在进化上有关联的sarbecoviruses（SHC014、Rs4081、RaTG13和SARS2 Wuhan）的RBD通过基因融合技术结合在一起，制造了一个含有多种病毒抗原的复合体（称为“Quartet”）。这个多病毒Quartet的设计允许与之前描述的Mosaic-4疫苗进行比较。为了实现在SpyCatcher003-mi3纳米颗粒上的多价展示，研究者为Quartet设计了一个用于哺乳动物细胞分泌的信号序列和一个末端SpyTag。通过SpySwitch系统，Expi293F细胞有效地分泌并纯化了Quartet。Quartet在SDS-PAGE上的条带较宽，这是因为天然糖基化的变化所致。使用肽N-糖苷酶F（PNGase F）去除N-连接的糖基后，条带位置向下移动。Quartet-SpyTag在尺寸排除色谱中显示出均匀的峰。研究者证实了Quartet与SpyCatcher003-mi3的有效偶联。

图|多病毒Quartet纳米笼的制备

Quartet 纳米笼可提高针对多种sarbecovirus 的抗体

研究者评估了Quartet纳米笼作为免疫原的能力，通过ELISA测试了小鼠免疫后的IgG抗体滴度。Quartet纳米笼在初次免疫后对SARS2武汉RBD产生了最高的抗体反应，并且在增强免疫后保持了对SARS2的强免疫反应。此外，Quartet纳米笼还能有效诱导对非免疫原RBDs的交叉反应性抗体。研究结果表明，Quartet纳米笼可能具有对抗多种sarbecoviruses的广泛保护潜力。此外，研究者发现RBD在Quartet链上的位置与抗体滴度之间没有明显关联。

图| Quartet纳米笼免疫产生的广泛免疫反应

Quartet 纳米笼和Mosaic纳米颗粒的比较

研究者将新型的Quartet纳米笼疫苗与现有的Mosaic纳米粒子疫苗进行了比较，后者具有随机排列的RBDs。他们还创建了一种新的Quartet，包含不同的sarbecoviruses RBDs，并将其与SpyCatcher003-mi3结合，形成Dual Quartet 纳米笼，以展示与Mosaic-8相同的多种RBDs。

实验结果表明，Quartet 纳米笼和Dual Quartet 纳米笼在提高抗体滴度方面效果显著，且对某些未包含在疫苗中的RBDs也有免疫反应。Mosaic-4和Mosaic-8疫苗相比SARS2同型纳米笼，对sarbecoviruses RBDs产生了更高的抗体滴度。此外，研究者发现RBD在纳米笼上的位置并不影响免疫反应的强度。所有疫苗成分（除了未偶联的四聚体）都诱导了对SpyCatcher003-mi3的相似抗体反应，而SpyTag-MBP作为阴性对照，显示出极少的抗体反应。

图|Mosaic或Quartet纳米笼免疫效果的比较

Quartet 纳米笼诱导中和抗体

研究者测试了Quartet纳米笼对SARS-CoV-2和Delta变种的中和能力，发现Quartet纳米笼在诱导中和反应方面优于其他免疫原。Dual Quartet 纳米笼在中和SARS1伪病毒方面表现最佳，而Quartet 纳米笼和Mosaic-8也展现了较强的中和能力。为了增强免疫效果，研究者还使用了更高剂量的抗原和AddaVax佐剂。此外，研究者开发了包含SARS2 XBB.1.5的Kraken Quartet，以对抗新兴的抗体逃逸变种。实验结果显示，Quartet和Mosaic免疫原在诱导对多种SARS2 VOCs的抗体结合方面效果相似，而含有XBB.1.5的免疫原对XBB.1.5伪病毒的中和能力显著提高。这些发现证明了Quartet纳米笼平台能够适应并保护免受新出现的病毒变种的影响。

图| Quartet免疫原诱导的中和作用

对具有现有免疫力的小鼠进行Quartet 纳米笼免疫

考虑到全球大多数人已经接种了SARS-CoV-2疫苗或曾经感染过，研究者探索了在已有免疫反应的情况下，是否能够通过增强免疫激发广泛的抗体反应。他们首先使用SARS-CoV-2武汉株的Spike蛋白进行初次免疫，然后使用设计用来引发广泛免疫反应的Quartet 纳米笼进行增强免疫。出乎意料的是，即使在不含SARS-CoV-2序列的Quartet [SARS1]中，增强免疫后对SARS-CoV-2的抗体反应仍然类似。此外，Quartet 纳米笼和Mosaic-8免疫原在诱导对SARS1和BtKY72的抗体反应方面表现更佳。研究结果表明，Quartet纳米笼能够在已有特定病毒抗原偏见的情况下，诱导出广泛的抗sarbecoviruses反应，并且即使缺少SARS2组分，也能激发对SARS2的抗体反应，同时对多种sarbecoviruses产生广泛反应。

图|Quartet疫苗诱导广泛抗体，即使在预启动的SARS-CoV-2反应后也是如此

Quartet 纳米笼免疫原的进一步表征

研究者通过ELISA实验探究了不同位置的RBDs对抗体结合的影响，发现抗体结合能力与RBDs在纳米笼上的位置无关。为了验证灵活连接子对展示多RBDs的影响，他们制备了无连接子的Quartet纳米笼，并与常规Quartet纳米笼进行了比较，结果表明连接子的存在与否并不影响免疫反应。此外，通过酵母展示深度突变扫描技术，研究者分析了SARS2武汉株RBD逃避抗体结合的突变，发现Quartet纳米笼能够激发针对不同类别抗体的反应，而Dual Quartet 纳米笼和Mosaic-8免疫原主要激发对保守区域的抗体反应。这些发现有助于理解Quartet纳米笼如何激发广泛的免疫反应，即使在已有免疫偏见的情况下。

小结：

该研究成功开发了一种新型的Quartet纳米笼疫苗平台，能够高效表达并展示多种病毒的RBDs，从而诱导产生对广泛sarbecovirus的中和抗体。研究发现，即使在已有免疫偏见的个体中，Quartet纳米笼也能激发广泛的抗体反应，且其免疫原性不受RBDs在纳米笼上位置的影响。与传统的Mosaic-8疫苗相比，Quartet纳米笼虽然只包含少数组分，但能诱导至少相当甚至更强的免疫反应。此外，即使面对能够逃避现有抗体的Omicron变种，含有Omicron RBD的Quartet纳米笼依然能诱导出有效的中和抗体。研究还表明，Quartet纳米笼疫苗在增强免疫时能够有效地扩大对多种sarbecovirus RBDs的免疫反应，这对于开发能够应对未来病毒变种的疫苗具有重要意义。尽管研究存在一定的局限性，如仅在小鼠模型中进行，但Quartet纳米笼的发现为设计更有效的疫苗平台提供了有价值的信息，并可能推动预防性疫苗学的发展。

参考文献：

Hills, R.A., Tan, T.K., Cohen, A.A. et al. Proactive vaccination using multiviral Quartet 纳米笼 to elicit broad anti-coronavirus responses. Nat. Nanotechnol. (2024).

https://doi.org/10.1038/s41565-024-01655-9