Nature Nanotechnology：纳米泵送，纳米药物递送新途径！
小奇
2024-10-12
大多数致命疾病发生在固体组织中，这些组织限制了全身药物输送、精确靶向和最终的治疗效果。纳米颗粒（NP）携带和屏蔽大量药物和成像探针有效载荷的能力可以减少排泄和代谢，理论上有利于全身递送。NP可以改善药物的溶解度、稳定性、药代动力学和毒性特征。尽管纳米化学取得了非凡的进步，包括功能化以寻找关键靶点，但它们的靶向精度和治疗效益仍然难以捉摸，因为NP大小（i）限制了从血液进入关键组织，导致靶组织浓度不足，（ii）促进了不希望的网状内皮系统（RES）摄取，导致血液水平降低，靶组织药物减少，毒性增加，特别是在RES组织中。为了最大限度地提高其治疗效果，每个NP必须穿过内皮细胞（EC）单层衬里的血液微血管，到达所需固体组织的间质，以与其靶标结合并释放药物。所有NP都依赖于被动的经血管交换，主要是通过开放的窗孔、瞬时的经内皮通道、细胞间连接和/或相邻EC之间的间隙进行扩散和/或对流。RES器官具有非常渗漏、不连续的内皮细胞，具有较大的间隙，能够快速进入NP、血液清除和大部分积聚。但对于所有其他受到更严格的连续EC屏障和RES清除无益分流阻碍的组织，只有极少量的NP剂量在靶组织内缓慢积累。预防RES摄取的方法有助于延长循环时间，但精确靶向组织穿透仍然是未解决的挑战。被动外渗似乎效率太低，以至于NP无法在非RES固体组织内与预期的同源靶标结合。由于关键靶组织内积聚的NP剂量不足2%，且临床成功率低，一些科学家甚至争论全身纳米递送是否是一种徒劳的治疗策略。相比之下，NP的天然组织取向导致了系统性肝脏疗法的发展，并取得了显著的成功。迫切需要新的递送策略，以便在非RES组织内实现纳米载体的巨大前景。尽管进行了数十年的研究，但如何最好地让NP跨越连续的EC障碍仍然不清楚。所有持续的内皮细胞都限制了NP的渗透，即使是那些具有大量特殊质膜内陷的内皮细胞，称为小窝，可以形成各种瞬时的跨内皮通道和离散的囊泡，运输到细胞内和穿过细胞。许多比典型NP更小的部分在连续内皮上的被动递送需要大剂量，以在血液-组织界面上产生相当大的浓度梯度，从而驱动组织进入。然而，即使在低剂量和相当大的浓度梯度下，微囊泡也可以被纯化以揭示有用的组织特异性递送靶点，并通过出芽形成动态离散囊泡来介导连续EC的主动转运，这些囊泡可以转运胞嘧啶选择结合探针。此类探针包括针对氨基肽酶P2（APP2）产生的mAPP2肺小泡靶向抗体（CTA），该抗体在体内高度聚集在肺EC小泡中。小窝泵送系统（CPS）通过从血液中提取大部分mAPP2并将其泵送穿过内皮，在静脉注射（i.v.）后几分钟内淹没肺间质，从而有效地将mAPP2浓缩在肺内。血液或其他器官中残留的mAPP2很少。尽管到目前为止还没有探针显示出与主动组织穿透类似的精确、稳健和快速靶向，但RES可以在提取速度和效率上与肺CPS相匹配，尽管可以进入多个组织。微囊泡是否可以类似地泵送静脉注射的CTA结合的NP尚不清楚，也不确定，因为微囊泡的直径很小，约为70 nm，RES在几分钟内清除血液中NP的能力很强。此外，小窝颈在血管壁上提供了约30 nm的圆形开口，这些开口面向外并垂直于血流。因此，大小和流体动力以及体内中预期的广泛EC糖萼可能会显著阻碍NP从循环血液进入小窝。到目前为止，所有显示肺经内皮泵送的mAPP2衍生物（Fab、scFv、双特异性和链霉抗体复合物）的流体动力学直径（HDD）均<15 nm。产生较大HDD的CTA偶联NP的靶向需要体内详细定量。鉴于此，加利福尼亚大学圣迭戈分校Jan E. Schnitzer研究人员通过将各种不同大小的NP与mAPP2偶联，研究了通过小窝进行的纳米泵送，以可视化和量化静脉注射后的组织靶向性。
研究人员描述了CPS的局限性，优化了HDD范围，以有效地将NP输送到肺部，并回答了关键问题：RES或肺部CPS是否会优先用于NP摄取，CTA是否会有效地重新定位NP，或者NP最终会将CTA重新定位到RES，NP的大小和类型会在多大程度上改变结果？最终，我们发现，通过将NP重新定向到CPS，将NP精确、快速和稳健地输送到肺部确实是可能的，CPS是一种新的主动跨细胞途径，可以超越目前被动经内皮输送的不足范式。本文的研究假设是CPS能够快速地从血液循环中提取纳米颗粒（NPs），并与网状内皮系统（RES）竞争。研究人员通过放射性标记树状高分子PAMAM，并与mAPP2结合，进行了实验验证。实验结果表明，mAPP2显著促进了NPs在肺部的积累，而非靶向的NPs则在肝脏和脾脏中积累。SPECT-CT成像显示，mAPP2-G5在注射后30分钟内快速在肺部积累，并在一周后仍可检测到。生物分布分析显示，mAPP2-G5在1小时内的肺部摄取量是对照组的40倍以上。结果证实了CPS能够高效地将NPs重新定向到肺部，即使在RES的竞争下也能有效工作。
图| APP2靶向PAMAM树突状NPs的生物分布成像和定量为探究CPS对纳米颗粒（NPs）尺寸的影响，研究人员选用了10、20和40 nm核心直径的球形胶体金NPs。这些NPs经PEG修饰后，与mAPP2或突变型mAPP2X直接结合，后者无法结合APP2，用作对照。通过尺寸排除色谱法确认了NPs的纯度，动态光散射测量得到免疫共轭NPs的流体动力学直径分别为23、33和64 nm。实验结果表明，mAPP2成功结合到NPs上，保留了APP2特异性，而mAPP2X及其NP共轭物则没有结合APP2。放射性免疫纳米共轭物（RINCs）通过将mAPP2和mAPP2X与125I标记后再与NPs结合制备，放射化学产率为70-85%，且在大鼠血清中37°C孵育24小时后保持稳定。总而言之，CPS能够处理不同尺寸的NPs，并通过mAPP2实现特异性靶向，而mAPP2X则作为有效的阴性对照。为了评估靶向潜力和动力学，研究人员在大鼠注射放射性免疫纳米共轭物（RINCs）后立即进行了全身平面成像。结果显示，随着NPs尺寸的增加，肺部摄取迅速减少。mAPP2在10分钟时产生了强烈的肺部成像，而GNP10和GNP20共轭物在1小时时肝脏摄取增加。GNP40共轭物在10分钟时主要显示肝脏成像，肺部摄取较低。ROI分析显示，所有RINCs的肺部摄取在几分钟内达到最大，而肝脏摄取对GNP40最快，但GNP10和GNP20在1小时后的信号增加，表明摄取动力学较慢。肺部信号随时间适度下降，而肝脏信号则迅速减少。甲状腺在4小时后对较大的RINCs有明显的积累，这可能是由于RES摄取和脱碘。图| 体内追踪肺内皮细胞小窝靶向GNPs随着核心直径的增加基于这些结果，研究人员将后续实验集中在注射后1小时，这是一个对RES和CPS都公平的时间点。SPECT-CT和平面成像显示，mAPP2及其RINCs在肺部有精准靶向，而mAPP2X及其RINCs则失去了这一能力，显示出在体内循环的非特异性信号。GNP10和GNP20在与mAPP2共轭时被驱动进入肺部，但与mAPP2X共轭时，它们的天然肝脏趋向性接管了靶向。GNP40与mAPP2X共轭时，特别明显地将抗体推向肝脏。生物分布分析显示，APP2靶向的放射性免疫纳米共轭物（RINCs）在肺部的摄取显著高于非靶向的mAPP2X-GNPs。GNP10和GNP20在肺部的摄取量显著，而GNP40则主要积聚在RES。所有靶向指数，包括ISI、TSI、SUV和TCPI，都证实了肺部CPS的重新靶向。mAPP2显著增加了与mAPP2X对照组相比的肺部摄取，而每种GNP都将mAPP2X有效地重新靶向到RES。肺组织靶向指数（TTI）对于mAPP2-GNP10和mAPP2-GNP20最高，但对于GNP40，肝脏和脾脏的TTI更高。TSI显示了优异的重定向肺部特异性，而GNP40增强了RES对mAPP2X的精准靶向。SUV和TCPI证实了CPS在肺部浓缩每种GNP尺寸的能力，尤其是对于HDD≤35 nm的NPs。ICP-MS分析结果与放射标记的结果相似，支持了抗体和GNP的共分布。mAPP2结合导致肺部与肝脏或脾脏的输送比率显著提高。研究结果表明，通过APP2靶向，可以有效地将RINCs重新定向到肺部，并且这种效应随着NP尺寸的增加而减弱。这些发现为设计有效的肺部药物递送系统提供了重要的见解。图| CPS在选择性地将NP重新定向到肺部并远离RES方面的作用几十年前，研究人员在纳米颗粒（NP）这个术语出现之前，就使用铁蛋白或蛋白包覆的金颗粒作为电子显微镜（EM）下的电子密集探针，观察到小窝在NP跨内皮转运中的动态作用。尽管早期研究显示NPs可以通过小窝被动转运，但效率低下，让人质疑其生理作用。该实验却发现，当小窝在体内被正确靶向时，它们能迅速而精确地将NPs浓缩到特定组织中，远超血液中的浓度。这一发现首次展示了小窝泵送系统（CPS）在NP输送中的高效率。数据显示，CPS的浓缩能力不是通过被动扩散，而是通过主动的囊泡转运实现的。非靶向的NPs显示出较少的体外扩散，表明特异性结合有助于提高转运效率。该研究显示，即使在RES迅速清除纳米颗粒（NPs）的情况下，通过小窝靶向，研究人员可以精确地将NPs输送到肺部。这种小窝泵送系统（CPS）的效率超过了被动输送和RES的清除能力，甚至能处理大于30 nm的NPs。CPS的快速作用可以在NPs被RES捕获前，迅速将它们拉入肺部组织。这表明，CPS可能比仅仅延长NPs循环时间的策略更有效。为了最大化这种效果，研究人员应该专注于尺寸小于25 nm的NPs，因为更大的NPs可能会被RES捕获。肺部的血液供应和微血管表面积有助于NPs的快速提取，但小窝的大小限制了它们对大尺寸NPs的摄取。因此，CPS的效率随着NPs尺寸的增加而降低。未来的研究需要探索其他组织的CPS靶向，并确定这种输送机制的普遍性和有效性。Nayak, T.R., Chrastina, A., Valencia, J. et al. Rapid precision targeting of nanoparticles to lung via caveolae pumping system in endothelium. Nat. Nanotechnol. (2024).https://doi.org/10.1038/s41565-024-01786-z
