西湖大学，Nature Chemistry！

米测MeLab

2024-11-29

特别说明：本文由米测技术中心原创撰写，旨在分享相关科研知识。因学识有限，难免有所疏漏和错误，请读者批判性阅读，也恳请大方之家批评指正。

原创丨米测MeLab

编辑丨风云

研究背景

α,β-不饱和羰基化合物是一类在有机合成中具有巨大实用性和多功能性的特殊分子。为此，在预先建立的分子框架内直接脱氢以在羰基官能团相邻处引入 C=C键是获取这些分子最理想的策略之一。在过去的几十年里，已经建立了大量实现羰基去饱和的方法，包括1978年报道的著名的Saegusa-Ito氧化以及各种较新的方法。

关键问题

然而，羰基去饱和的应用主要存在以下问题：

1、现有的羰基去饱和化方法反应条件较为严苛

目前，大多数现有羰基去饱和化方法需要使用高负载的金属或强氧化剂，或者涉及多步反应序列，这限制了这些方法的实用性和环境友好性。

2、能够精确控制去饱和过程的立体化学方法十分罕见

 能够精确控制去饱和过程的立体化学的方法非常罕见，这限制了对这种转化的全部合成潜力的探索，尤其是在实现高效合成有价值的手性α,β-不饱和羰基化合物方面。 

新思路

有鉴于此，西湖大学叶宇轩等人在此报告了一种生物催化平台，用于对环己酮进行去对称化去饱和，以生成具有远程四级立体中心的多种环己酮，通过重新设计“烯”还原酶来有效介导脱氢，即其天然活性的逆过程。这种基于“烯”还原酶的去饱和系统在温和条件下以空气作为终端氧化剂运行，可耐受氧化敏感或金属不相容的功能团，更重要的是，与使用小分子催化剂相比，它表现出无与伦比的立体选择性。机理研究表明，该反应通过 α-去质子化，随后进行速率决定的 β-氢化物转移进行。

技术方案：

1、阐述了生物催化反应的发现和优化过程

作者构建了ERED库，筛选出CrS和GkOYE在去饱和反应中表现最佳。通过定向进化，CrS和GkOYE的突变体显著提高了催化效率和对映选择性。

2、证明了酶去饱和方案的合成潜力和实用性    

作者开发的酶库展示了广泛的底物耐受性，成功催化多种4-烷基-4-芳基环己酮去饱和，包括含氧化敏感基团和杂环的底物，产率高，对映选择性好。克级规模反应和产物转化证明了该方法的合成潜力。

3、提出了生物催化去饱和反应的机制

研究揭示了生物催化去饱和反应的机制，包括α-去质子化和β-氢化物转移，并通过实验验证了关键步骤。

技术优势：

1、开发了生物催化平台实现了对映选择性脱氢

作者通过利用黄素依赖性“烯”还原酶（ERED）的固有遗传多样性，并结合定向进化技术，成功解决了羰基去饱和化过程中的挑战，实现了对映选择性脱氢。

2、开发基于ERED的去饱和系统，实现了无与伦比的立体选择性

作者开发了一种基于“烯”还原酶的去饱和系统，该系统能够在温和条件下以空气作为终端氧化剂运行，并且展现出对氧化敏感或金属不相容的功能团的耐受性，以及无与伦比的立体选择性，这在以往的小分子催化剂中是难以实现的。

技术细节

反应发现和优化

作者构建了一个结构多样的ERED库，评估了它们在有氧条件下对4-甲基-4-苯基环己酮进行对映选择性去饱和的催化效率。大多数酶活性较低，但OYE1、OYE2、CrS和GkOYE表现出中等活性和良好的对映选择性。反应优化显示，一些ERED的脱氢活性随温度升高而提高，如TOYE在50°C下的产率是室温下的八倍。热稳定性ERED在接近其熔化温度T_m下测试，CrS和GkOYE表现出最佳性能，产率分别达到30%和49%，对映体比均为98:2。通过定向进化，对CrS和GkOYE进行了多轮位点饱和诱变，提高了它们的催化性能。CrS的Y27突变为较小氨基酸残基显著提高脱氢活性，而GkOYE的三重突变体GkOYE3以96%的产率和>99:1的对映体比催化生成2。    

图  羰基脱饱和反应

图  CrS和GkOYE酶去对称脱氢反应的发现和定向进化

范围和限制

该研究通过构建一个包含有益突变体的重点酶库，探索了酶系统对各种4-烷基-4-芳基环己酮底物的耐受性。结果显示，环己酮苯环上的多种取代基如氯、甲氧基、三氟甲基、二甲氨基和甲硫基均被良好耐受。特别地，含2-氨基苯基的环己酮底物通过去饱和形成的烯酮中间体自发分子内环化，以99%产率生成酮吲哚，具有出色的非对映选择性。该生物催化去饱和方案对氧化敏感功能基团如胺和硫醚表现出高耐受性，电子缺乏和丰富的杂环也是相容的。此外，多种烷基和含酯环己酮也顺利参与反应，展现了良好的产率和对映选择性。在克级规模上，模型反应也取得了高产率和高对映选择性的结果，进一步证明了该酶去饱和方案的合成潜力和实用性。    

图   4-烷基-4-芳基环己酮去对称脱氢的范围  

图  其他类别环己酮的去对称脱氢范围 

图  制备规模合成和产品衍生化

机理分析

本研究提出了生物催化去饱和反应的机制。底物1在保守酪氨酸阴离子Y169作用下α-去质子化，形成烯醇盐Int1，然后通过路径A转移β-氢化物至FMN_ox，生成去饱和产物2和FMN_hq，或通过路径B进行单电子转移形成α-酰基自由基中间体Int2和FMN_sq。氘掺入实验显示Y169促进两个α质子的去质子化，而Y169A突变体显著降低去饱和活性。自由基钟实验表明反应符合β-氢化物转移机制。动力学研究揭示α位和β位的KIE值与提出的反应途径一致。GkOYE3在去饱和半反应中比GkOYE-WT快约57倍，在反向还原中慢约0.7倍，与氧气反应中快约1.5倍，表明定向进化产生的突变体在关键步骤中去饱和效果更好。    

图  机理分析

展望

总之，作者利用此类酶的遗传多样性和定向进化的力量，成功地将ERED重新用于高效和对映选择性脱氢。该生物催化脱饱和平台代表了一项具有广泛合成用途的宝贵进步，能够在温和条件下使用空气作为终端氧化剂获得具有远程四级手性中心的多种环己酮。这种去对称化脱氢反应为未来开发生物催化脱饱和系统奠定了基础，其反应性和选择性是小分子催化剂无法比拟的。 

参考文献：

Wang, H., Gao, B., Cheng, H. et al. Unmasking the reverse catalytic activity of ‘ene’-reductases for asymmetric carbonyl desaturation. Nat. Chem. (2024). 

https://doi.org/10.1038/s41557-024-01671-1