经典催化反应，再发Nature！
纳米人
2025-02-11
亲核芳香取代反应（SNAr）是目前药物化学和农药化学领域应用最广泛的反应类型，通过SNAr反应构筑C-C和C-X化学键（X=O, N, S）的方式构建复杂结构有机分子。SNAr反应通常需要较强的反应环境，比如使用极性非质子溶剂，化学计量比的碱性物质，升高的反应温度，这导致难以控制反应的选择性。在SNAr反应之外，人们还开发了几种催化反应，包括有机分子氢键或者相转移催化反应。有鉴于此，曼彻斯特大学Igor Larrosa教授、Anthony P. Green教授等通过设计活化的Arg（精氨酸）残基的酶进行生物催化反应，实现了立体选择性SNAr反应。通过多轮定向进化得到的工程化酶催化剂SNAr1.3比未工程化的酶催化剂性能提高了160倍，对缺电子芳烃实现了接近完美（>99 % e.e.）的立体选择性控制。SNAr1.3的反应速率达到0.15 s-1，TON达到>4000，对广泛的亲电试剂和亲核试剂具有兼容，包括挑战性的1,1-双芳基立体结构。通过生化、结构、理论计算研究，揭示了SNAr1.3的催化反应机理。反应机理包括Arg124和Asp125关键残基形成了一个卤结合口袋。这项研究通过酶催化反应实现了具有里程碑意义的合成反应，为SNAr催化反应提供了高效率普适性的方法。图1. SNAr（亲核芳基取代反应）和立体选择性SNAr enzyme的定向进化为了得到合适的酶起始模板，作者从前期研究发现具有可编程活性位点的Morita-Baylis-Hillman酶（MBH）开始。MBH酶具有Arg124残基氢键供体能够与相邻的缺电子芳烃结合。由于人们在以往的研究中发现氢键催化剂能够加快SNAr反应速率，因此首先测试一系列MBH酶的混杂SNAr反应性，发现BH32.8变体（记作SNAr1.0）能够进行乙基-2-氰基丙酸酯（1）和2,4-二硝基氯苯（2）的SNAr偶联，BH32.8变体具有适中的转化率和适中的立体选择性（ca. 5 % e.e.）（图1b）。随后，对BH32.8（SNAr1.0）其进行工程化设计，改善反应活性和立体选择性（图1c）。首先对活性位点、以及二级配位球附近的41个残基基团使用NNK退化密码子进行随机突变，随后通过UPLC监控1和2转化为3的反应情况。选择其中最好的变体进行下一轮的突变，将得到的有希望的突变体结合DNA改组（shuffling）方法结合。总共对4000个克隆体的测试，其中六个突变体作为SNAr1.3变体（图1c和1e）。在His23残基（MBH酶的关键亲核位点）的进化过程（排除His23残基的亲核催化SNAr），发现突变体能够实现93 %的转化率，而且生成的唯一产物是3，比SNAr1.0仅为3 %的产率明显更好，而且该突变体同样得到更好的立体选择性，立体选择性达到96 % e.e.（远高于SNAr1.0的5 % e.e.）。通过X射线衍射表征得到产物3的绝对结构。在制备量级的合成反应中，以51 mg的2能够达到90 %的转化率，产物3分离收率达到70 %。重结晶的产物立体选择性达到98 % e.e.。通过动力学实验测试催化反应的详细情况，结果表明反应动力学常数提高160倍，SNAr1.0和SNAr1.3的动力学常数分别为0.0040±0.0002 min-1和0.65±0.01 min-1，随后在1的饱和浓度下测试反应动力学，结果kcat/kM2增强160倍。此外，当PBS缓冲液变成磷酸钠，反应速率能够进一步提高3倍，这是因为较高的Cl离子浓度阻碍酶催化性能。调节卤离去基团对SNAr1.3催化活性和选择性的影响。当使用2的溴（4）和碘（5）类似物进行反应，酶催化活性分别提高3.8倍和8.6倍（图2b）。当使用碘的类似物（5），反应速率达到8.81±0.11 mM-1 min-1，产物3的立体选择性超过99 % e.e.，而且酶催化反应的TON达到4000（图2c）。通过制备量的反应（当SNAr1.3的量仅为0.5 mol %，能够以>99 %的转化率和91 %的分离收率和99 % e.e.立体选择性生成150 mg (R)-3），验证了酶催化反应的应用前景。反应兼容性。通过对各种亲电、亲核偶联反应物的兼容性测试，研究了SNAr1.3的兼容性（图3a）。非常重要的是，SNAr1.3对许多硝基芳烃兼容，包括氰基、三氟甲基、酯、酮、磺基、吡啶环的底物兼容，能够得到较好或者优异的e.e.立体选择性（图3a），而且在这些反应中没有发现副反应产物生成。此外，反应对亲电试剂具有非常好的兼容性，比如酯、酰胺、2-烷基取代基，对含有C-芳基的环状β-酮酯同样兼容。这个结果与化学催化反应（使用化学计量比的碱或者小分子有机催化剂）生成O-芳基化和C-芳基化混合物的现象明显区别。此外，SNAr1.3能够使用乙基2-硝基丙酸酯合成含有四级N立体中心的光学纯化合物。另外SNAr1.3能够使用苯酚或者活化的有机醇作为亲核试剂（pKa<12.4）构筑C-O化学键，形成双芳基醚或者芳基烷基醚。构筑1,1-双芳基的四级碳结构化合物。该反应能够构筑生物活性化合物中常见的双芳基四级碳结构，这种结构的立体选择性构筑是个非常大的挑战。作者测试了2和乙基2-氰基-2苯乙酸的反应，使用SNAr1.2实现了适中的转化率（27 %）和适中的立体选择性（46 % e.e.）。随后通过定向进化得到变体SNArPh1.0，催化活性提高3倍，并且立体选择性达到84 % e.e.。当使用芳基碘化物作为反应物替代芳基氯，转化率能够提高至96 %，立体选择性达到87 % e.e.。实验结果表明SNArPh1.0能够作为具有应用价值的催化剂合成各种1,1-双芳基化产物。作者通过生化实验、结构表征、理论计算等研究手段研究SNAr1.3的催化反应机理，以及酶进化是如何增强催化反应的活性。首先，验证了SNAr是否与4-氯苯甲酰-CoA脱卤酶（4-chlorobenzoyl-CoA dehalogenase）类似，通过形成酶-反应物的共价结构中间体，作者将SNAr1.3和芳基卤化物5分子在没有加入亲核偶联试剂的情况下，放在一起培养。随后检测卤的产生以及蛋白的质量变化情况。观测发现没有因为芳基卤化物水解产生的酚类产物。结果表明在催化反应（8.8 min-1）的区间内，没有产生酶和反应物形成的共价结构中间体，说明SNAr1.3催化反应过程没有生成芳基-酶的中间体。通过X射线晶体表征（1.8 Å）研究SNAr1.3的反应机理。通过K39A变体在蛋白表面进行结构表征分析，结构表征结果表明SNAr1.3与SNAr1.0没有明显区别（RMSD 0.89 Å）。随后的表征发现两个内部碘结合位点，结合位点由Met64、Arg65、Arg124、Asp125、Pro128构成（图4a）。Arg和Asp是天然卤结合口袋常见的残基位点。将SNAr1.3和5一起进行结晶，得到的结构发现两个不同的结构，表明反应物结合具有异质性。5结合的位置主要位于卤结合空位（图4b），同时在芳基反应物的下部具有另一个空位，能够用于容纳亲核性的偶联反应物分子。对卤结合位点进行位点选择性突变研究。R124A和D125N/A突变能够将反应速率降低180倍或者68/22倍，M64A和R65A变体导致反应速率降低5.4倍或10倍。这些研究结果进一步的说明，卤结合口袋对于催化反应的重要作用。总之，这项研究为SNAr催化反应建立了酶催化反应的解决方案，SNAr反应是化学工业领域最重要的转化反应类型。这项研究关注于开发能够构筑四级碳立体位点的酶催化剂。这项研究表明，这种SNAr酶能够用于合成含氮的立体中心位点，构筑C-O化学键，进行区域选择性的SNAr反应，表明着这种工程化的酶催化剂具有广阔的合成应用前景。这项研究开发的SNAr酶具有令人印象深刻的催化活性、选择性、反应物兼容性。这项研究仅仅包括4000个变体，深入的研究蛋白的序列能够的高更多具有前景的SNAr酶催化剂，包括对更加惰性的亲电、亲核试剂兼容。结构和机理研究为开发SNAr1.3用于高效选择性催化的活性位点提供帮助。这项研究的分析结果为从头设计特定功能需求的SNAr酶催化剂的设计提供帮助。通过将现代蛋白设计方法和高通量的实验室进化技术结合，这项研究有助于推动开发更多更具价值的SNAr变体，促进现有合成方法学的发展。
参考文献
Lister, T.M., Roberts, G.W., Hossack, E.J.et al. Engineered enzymes for enantioselective nucleophilic aromatic substitutions. Nature (2025).
DOI: 10.1038/s41586-025-08611-0
https://www.nature.com/articles/s41586-025-08611-0
