唐奕Nature：C-H键转化，新发现！
纳米技术
2025-02-20
唐奕教授本科毕业于宾夕法尼亚州立大学，在David A. Tirrell教授完成博士，在Chaitan Khosla教授的指导下完成了博士后的工作，他的研究方向主要集中在天然产物生物合成和生物催化领域。曾获美国总统奖、美国化学学会Author C. Cope 奖等多项殊荣。C-H键是有机分子中最常见的化学键，因此C-H键在化学合成中处于非常重要的地位。C-H键转化反应关键的挑战是如何选择性对特定C(sp3)-H化学键进行转化。在这些年，人们发现金属酶能够催化C(sp3)-H化学键的官能团化。虽然近些年得到显著的发展和进步，但是对惰性C(sp3)-H键的酶催化卤化反应仍然只能通过非血红素Fe/α-酮戊二酸依赖性卤化酶（α-ketoglutarate-dependent halogenase），因此导致化学可及性受到局限。 有鉴于此，加州大学洛杉矶分校唐奕教授、Masao Ohashi教授等报道在含有未知功能结构域3328（DUF3328）的蛋白质家族中，发现了一种未曾发现的卤化酶ApnU，并进行表征。ApnU在活性中心位点使用Cu作为催化剂，对多个惰性C(sp3)-H键进行迭代催化氯化。通过Cu金属中心具有的较软特点，ApnU展现了出乎预料的酶催化C(sp3)-H官能团化性能，包括碘化（iodination）和硫氰化（thiocyanation）。通过生化特征和蛋白质组学分析，鉴定了ApnU的低聚功能态（oligomeric state），这种低聚态呈现了共价连接的二聚体，其中含有由双硫键形成的三个基本结构，一对是链间双硫键，两对链内双硫键。通过ESR表征，验证ApnU含有的金属配位活性位点含有双核II型Cu中心位点。这项研究发现拓展了卤酶催化C(sp3)-H卤化反应的能力，为双核Cu依赖性氧化酶的提供基础性的理解。酶的功能未知3328(DUF3328)域在真菌天然产物生物合成途径中广泛的存在，根据其基因特点，其包括C(sp3)-H氧化官能团化，包括成环、去饱和、羟基化、氯化。ApnU是这种酶家族的一种，比如atpenin B (1), atpenin A4 (2), atpenin A5 (3)（图1c）。首先，通过基因失活（ genetic inactivation）验证了ApnU在氯化反应中由1转化为2和3的情况，发现敲除apnU之后，2和3消除，但是1逐渐累积；随后，补充apnU之后，恢复了生成2和3的活性。 通过分析序列和结构，发现ApnU含有两个HXXHC结构，四个His侧链能够形成平面的四个角（约5.4Å×6.1Å），两个半胱氨酸残基位于平面下方（图1d）。ApnU的结构预测结果表明其含有49个残基（编号31-79）的N-终端跨膜螺旋结构（N-terminal transmembrane helix）（图1d）。将75 N终端残基替换为可溶的标签（10个氨基酸序列：MAKKTSSKGK），得到部分可溶的蛋白并进行提纯。将纯化的蛋白与1、康坏血酸、NaCl一起进行培养，发现1转化为单氯化2主要产物的转化率较低（10 %），生成二氯化产物3次要产物。向反应中加入EDTA后反应活性消失，表明酶催化活性具有金属依赖性。在优化的条件下，能够从包涵体中重新折叠蛋白质，获得可溶的ApuU。将重新折叠的apo-ApnU与1、抗坏血酸、各种过渡金属（Mn(II), Fe(II), Co(II), Ni(II), Cu(II), Zn(II)）进行培养，LC-MS表征结果表明，只有在Cu(II)存在时，1具有氯化反应活性，50 %的1转化为氯化产物3和4。其中，4的质谱为m/z=400，对应于三氯化产物。此外发现少量5产物（m/z=296），对应于1的脱氢产物。放大量反应并且分离4和5，进行NMR表征。NMR表征结果表明4号分子的第三个氯位于3的C5′位点，得到偕二氯的四级碳原子。总之，以上研究结果表明ApnU是首个被发现能够迭代C(sp3)-H氯化的Cu依赖性卤化酶。 与大多数Cu金属酶相似，ApnU通过O2作为氧化剂活化C-H键，在无氧条件下ApnU没有表现催化活性（图2c）。抗坏血酸作为必不可少的还原剂，其他的还原剂（比如DTT(二硫苏糖醇)和Na2S2O4）无法用于氯化反应（图2d）。在pH 6.0 MES缓冲液中，ApnU获得最好的氯化反应活性。当NaCl浓度增加，氯化程度（3 vs 4）增加，在浓度为50 mM NaCl时得到最大的氯化反应数目。在没有氯化物的情况，整体催化活性明显降低，表明氯化物与Cu中心之间的配位对于C(sp3)-H键活化非常重要。由于ApnU使用的是软金属Cu用于卤化反应，因此作者认为ApnU能够与Fe依赖性NHFeHal起到不同的卤化物/准卤化物进行反应。因此，将不含氯的ApnU与1以及不同的阴离子进行活性测试，结果表明能够与Br-、N3-、NO2-生成官能团化的加合物（与Fe依赖性NHFeHal类似）。此外，柔性更高的阴离子（I-、SCN-、SeCN-）同样能够反应（Fe依赖性NHFeHAl不具有这种催化活性）。在这些阴离子浓度更高的情况下，反应只能生成单取代的产物，而且没有副产物生成。放大量实验能够合成并分离碘化物、硫氰酸盐产物、硒氰酸盐产物（6-8）。通过NMR分析发现反应的区域选择性是C5′（图2e）。当使用F-、CN-、OCN-、HCOO-、NO3-、CH3S-，未见产物生成（图2e）。ApnU的独特Cu活性位点使得ApnU实现了区域选择性的C(sp3)-H官能团化转化。这种非Fe依赖性卤化酶拓展了酶催化C(sp3)-H键官能团化的种类。在重新折叠形成ApnU的过程中，需要加入GSH/GSSG，当GSH和GSSG的量相同，折叠的效果最好。当不加入GSH/GSSG，虽然能够获得可溶的蛋白，但是得到的蛋白完全没有催化活性。这个结果表明ApnU的六个半胱氨酸进行正确重构是蛋白质折叠的关键。 使用阴离子交换色谱、尺寸排阻色谱表征，发现重新折叠的ApnU具有两个主要物种（I和II），质量为30 kDa（图3a）。分别分离并提纯，发现只有I具有氯化酶的催化活性，II没有氯化酶的催化活性。通过LC-QTOF-MS表征变性蛋白的质谱，发现分子量为59,056 Da，对应于ApnU的二聚体，并且对应于由于生成二硫化学键导致减少12-Da（图3b）。通过天然蛋白质的质量分析，进一步证实了ApnU的二聚体状态。对HXXHC的四个his进行突变，验证四个his对于ApnU的活性都是必须的，这可能是因为其Cu结合的作用。通过ICP-MS表征His6-tag-free ApnU，发现每个ApnU的金属最大结合数目为2.3±0.1。通过EPR表征His6-tag-free ApnU的Cu中心位点结构和性质。当加入过量的Cu(II)，并且通过脱盐或者透析处理干净样品，含有Cu(II)的ApnU的EPR谱结果表明type II型Cu(II)信号，每个活性位点具有接近2个Cu原子自旋（图4a）。加入过量抗坏血酸或者在无氧条件测试，发现Cu(II) EPR信号消失，验证了抗坏血酸将Cu(II)还原为Cu(I)启动催化反应。 模拟EPR谱的结果表明两个有所区别的Cu(II)信号g值和超精细耦合常数Az(Cu)（图4a），表明每个Cu(II)处于N/O混合配位环境和平面四方形结构。观测的g≈2.05的信号超精细裂分结果分析发现应该是14N与Cu(II)之间的超精细相互作用，这个结果支持了Cu结合位点。光谱表征结果表明，静息态的两个Cu没有磁耦合，表明两个Cu(II)原子的间距超过6 Å。根据实验结果，以及已知的双核Cu酶催化机理，DFT理论计算，提出了ApnU的可能卤化反应机理（图4b）。静息态含有两个没有耦合的Cu(II)中心，随后通过抗坏血酸还原为Cu(I)，随后O2活化生成过氧桥连双核INT1(μ-η2:η2-peroxo)Cu(II)Cu(II)。Cu中心与阴离子配位，形成INT2，通过抗坏血酸发生摘氢原子反应生成INT3(μ‐O·)(μ‐OH)Cu(II)Cu(II)。INT3是反应活性物种，能够从反应物1摘氢，计算结果表明该步骤的能垒为4.4 kcal mol-1，通过该步骤生成卤化产物，同时消耗一个Cu(II)位点。随后另一个Cu(II)与抗坏血酸反应重新开始催化反应。这项研究发现了从前未知的ApnU（从属于真菌蛋白的DUF3328家族），并且进行生化分析表征。ApnU是Cu依赖性催化剂，能够对多个C(sp3)-H键进行迭代的氯化，ApnU含有保守的双HXXHC结构（其他DUF3328蛋白同样存在），通过EPR和ICP-MS表征验证与两个Cu(II)金属离子结合。ApnU的Cu中心具有超预料的C(sp3)-H官能团化性能，这些催化活性与Fe的卤化酶不具备的。虽然人们发现黄素依赖性卤化酶能够进行区域选择性C(sp3)-H碘化，但是ApnU能够进行位点选择性的C(sp3)-H碘化反应、硫氰酸化反应、硒氰酸化反应。Fe依赖性酶虽然具有优秀的催化活性，而且容易进行进化，但是Cu依赖性酶仍然展现了对酶催化C(sp3)-H键官能团化反应种类的拓展。这项工作为研究目前未曾关注的DUF3328金属酶家族提供广阔的机会，有助于开发新型酶功能。 Chiang, CY., Ohashi, M., Le, J. et al. Copper-dependent halogenase catalyses unactivated C−H bond functionalization. Nature (2025).DOI: 10.1038/s41586-024-08362-4https://www.nature.com/articles/s41586-024-08362-4
