南京大学&厦门大学，Nature Catalysis！

米测MeLab

2025-07-08

第一作者：Bin Chen, Qiaoyu Zhang, Jinhai Yu

通讯作者：王斌举, 黄小强

通讯单位：南京大学，厦门大学

全文概要

南京大学&厦门大学的研究团队在《Nature Catalysis》发表突破性研究，首次利用工程化烯还原酶（ene-reductases, ERs）实现了氧中心自由基（O-自由基）与烯烃的高效、高对映选择性分子间氢烷氧基化反应（图1）。该工作通过单酶催化体系，在无光条件下精准调控O-自由基的生成、烯烃加成及手性终止，解决了传统化学催化中立体控制难、条件苛刻等瓶颈问题。结合实验与理论计算，作者揭示了基态单电子转移（SET）机制与立体选择性的分子基础，并成功拓展至氘代药物合成。这一策略不仅拓展了生物催化自由基反应的边界，更为绿色合成手性醚类化合物提供了新范式，对药物开发和功能分子构建具有重要价值。

图1. 烯还原酶催化的O-自由基分子间氢烷氧基化反应

一、研究背景

氧中心自由基（如烷氧自由基）是一类高活性的开壳层中间体，在有机合成中具有重要价值。其典型反应模式包括氢原子转移（HAT）、β-断裂以及分子内加成到烯烃，但分子间不对称加成反应一直未被实现。传统化学催化依赖光氧化还原或贵金属催化，且难以控制立体选择性。近年来，酶催化非天然自由基反应取得进展，但O-自由基的利用仍属空白，主要因其高反应活性易导致副反应，且缺乏有效的生成与调控方法。

二、研究思路

1. 催化体系的设计

作者提出利用天然烯还原酶（ERs）的还原能力，通过其辅因子FMN（黄素单核苷酸）的氢醌形式（FMN_hq）在基态下发生单电子转移（SET），将N-烷氧基吡啶盐还原为O-自由基（图2）。该设计避免了光激发需求，通过酶活性位点的空间限制实现自由基的定向加成与立体控制。

图2. ER辅助的对映选择性自由基生物催化

2. 反应优化与酶工程

以α-甲基苯乙烯（1a）和N-甲氧基吡啶盐（2a）为模型底物，作者筛选了多种ERs，发现来自Yersinia的YerSER优先生成（R）-产物（e.r. 2:98），而Gluconobacter来源的GluER则倾向于（S）-产物（e.r. 85:15）。通过半理性突变（如H128Y、Q232L），作者获得双突变体GluER-H128Y-Q232L，将（S）-3a的产率提升至76%，e.r.优化至92:8（图3）

图3. 反应优化与酶工程

3. 底物拓展与多样性合成

该策略适用于多种烯烃和O-自由基前体（图4）。苯环对位、间位、邻位取代的α-甲基苯乙烯（3a-k）、二取代烯烃（3l）及噻吩衍生物（3m）均能高效转化。四氢萘衍生物（3n-o）表现出优异的非对映选择性（d.r. >20:1）。此外，作者还实现了β-位氘代醚的合成（氘代率>99%），为药物修饰提供了新途径。

图4. 底物拓展

4. 机理研究

通过实验与理论计算结合，作者揭示了反应机制（图4和图5）：

O-自由基的生成：N-烷氧基吡啶盐（如2a）在ERs的活性中心被FMN_hq（还原态黄素）通过单电子转移（SET）还原，均裂N-O键生成高活性甲氧基自由基（·OMe）。该步骤经QM计算验证为放热过程（ΔG = -21.7 kcal/mol），且无需光激发（图5a）。

烯烃加成与手性控制：O-自由基与烯烃（如α-甲基苯乙烯1a）的分子间加成在酶活性腔中完成。QM/MM模拟显示，底物构象（CH₃-左/右）决定过渡态能垒差异：S-构型路径（如GluER-H128Y-Q232L催化）：CH₃-左构象中，甲氧基与烯烃距离更近，C-O键形成能垒更低（近乎无势垒）。R-构型路径：CH₃-右构象因空间位阻导致能垒升高2.6 kcal/mol。这种构象依赖性使得不同ERs可选择性生成（S）-或（R）-产物（如YerSER偏好R-构型，e.r. 2:98）。

氢原子转移（HAT）终止：生成的苄基自由基中间体（Int. D）通过FMNhqhq介导的HAT步骤立体选择性淬灭（能垒10 kcal/mol），最终形成手性醚产物（如3a）。氘代实验（D-葡萄糖为氘源）证实HAT由辅因子直接参与（氘代率>82%）。

图4. 黑暗条件下的催化循环

图5. 反应机理与立体选择性分析

三、小结

本文开发了一种基于工程化烯还原酶的生物催化策略，首次实现了氧中心自由基（O-自由基）与烯烃的对映选择性分子间氢烷氧基化反应。该策略通过单酶催化体系，在无光条件下高效调控O-自由基的生成、烯烃加成及手性C-自由基终止，实现了高化学选择性和对映选择性（最高对映体比例e.r.达99.5:0.5）。

原文详情

Bin Chen, Qiaoyu Zhang, Jinhai Yu, Beibei Zhao, Ran Ge, Zihan Zhang, Ding Luo, Binju Wang & Xiaoqiang Huang. Steering oxygen-centred radicals with ground-state ene-reductases for enantioselective intermolecular hydroalkoxylations. Nature Catalysis (2025). 

https://doi.org/10.1038/s41929-025-01372-z