杨扬/刘鹏，Science！

米测MeLab

2025-08-04

特别说明：本文由米测技术中心原创撰写，旨在分享相关科研知识。因学识有限，难免有所疏漏和错误，请读者批判性阅读，也恳请大方之家批评指正。

原创丨米测MeLab

编辑丨风云

研究背景

多样性导向合成是应对化学和生物挑战的有力策略，通过生成具有优异骨架、官能团和立体化学多样性的化合物库。多组分反应因能从易得的构建块快速构建分子复杂性而特别吸引人。酶在具有挑战性的化学反应中展现出卓越立体控制能力。

关键问题

然而，酶驱动多样性导向合成的研究主要存在以下问题：

1、现有酶在多样性导向合成中的应用受限

除了多结构域的巨合成酶（如非核糖体肽合成酶和聚酮合酶），利用单一结构域酶或一组密切相关的酶突变体进行多样性导向合成仍然是一个艰巨的挑战。这主要是因为常见酶的底物范围狭窄，特别是那些用于碳-碳键形成的酶。

2、吡哆醛酶在三分子自由基碳-碳偶联中的挑战

尽管光生物催化领域已利用可见光照射诱导非天然酶活性，并成功将吡哆醛磷酸（PLP）依赖性酶用于双分子碳-碳键形成反应，但将吡哆醛酶应用于三分子自由基碳-碳偶联以生成结构多样化的产物仍是巨大难题。这源于自由基中间体的瞬态性质以及光催化剂-酶界面的复杂自由基传输动力学。

新思路

有鉴于此，美国加州大学圣塔芭芭拉分校杨扬教授、匹兹堡大学刘鹏教授等人发展了一种在有机化学和生物化学中未知的立体选择性三组分自由基介导的C-C偶联反应。重复使用的吡哆醛脱羧酶的定向进化使这种三组分偶联实现了全片段的可变性，产生了六类有价值的产物，其中许多是其他方法无法获得的，甚至是外消旋的方式。该酶学平台集成了一系列不对称催化原理，包括远程立体中心构建、立体发散催化、动力学拆分和平行动力学拆分，实现了对自由基中间体优异的非对映和对映控制。广泛的底物范围和进化的酶变体的互补特异性使组合库合成成为可能，为药物化学提供了结构和立体化学多样性的支架。

技术方案：

1、发了一系列立体选择性三组分自由基碳-碳偶联过程

研究通过协同光生物催化策略对脱羧吡哆醛酶进行定向进化，开发出立体选择性三组分自由基碳-碳偶联过程，生成六种独特产物。

2、发现了三组分偶联酶并进行定向进化

作者以苄基硼酸频哪醇酯、甲基丙烯腈和天冬氨酸为底物，筛选并优化PLP依赖性脱羧醛缩酶变体，通过定向进化和突变筛选，获得UstDAWMM变体，显著提高催化活性和非对映选择性，并实现动力学拆分。

3、强调了三组分自由基偶联卓越的底物普适性

进化后的生物催化剂UstDAWMM展现了广泛的底物耐受性，包括多种取代基、卤素、官能团、杂环及不稳定的烷基自由基。

4、探索了将其他α,β-不饱和底物作为自由基受体应用于三组分自由基偶联

作者探索了多种α,β-不饱和底物作为自由基受体的三组分偶联反应，证实了可将生成的环状亚胺产物转化为相应的多取代非天然脯氨酸，具有优异的非对映和对映选择性。

5、探索了利用该平台进行多样性导向的组合酶促合成的可能性

作者探索了多样性导向的组合酶车程的可行性，结果强调了酶工程在遍历广阔化学空间方面的巨大潜力，并为制药工业中的发现化学提供了新的途径。

6、解析了光生物催化三组分偶联的机制

本研究通过光物理和计算研究揭示光生物催化三组分偶联机制，发现光催化剂与生物催化剂自发结合，DFT计算解释高选择性，MD模拟揭示手性口袋形成及非共价相互作用对立体选择性的贡献。

技术优势：

1、开创性提出三组分自由基偶联反应

本文首次设计并实现了由定向进化的吡哆醛脱羧酶催化的立体选择性三组分自由基碳-碳偶联反应，这在有机化学和生物化学领域均属未知。该方法克服了传统酶的底物特异性限制，并展现出卓越的产物多样性和立体控制能力。

2、巧妙地集成多重不对称催化机制

该光生物催化平台巧妙地整合了多种高级不对称催化原理，如远程立体中心构建、催化剂控制的立体发散催化、酶促动力学拆分和并行动力学拆分。这使得能够精确控制自由基中间体，高效合成含有多个立体中心的复杂手性化合物。

技术细节

多样性导向的光生物催化合成通过立体选择性三组分自由基偶联

本研究利用协同光生物催化策略，对脱羧吡哆醛酶进行定向进化，成功开发了一系列立体选择性三组分自由基碳-碳偶联过程，这些过程在有机化学和生物化学中均属首次实现。该平台通过对所有三个自由基偶联组分的结构变异性兼容，生成了六种具有多样分子骨架、官能团组成和明确立体化学排列的独特产物类别。该方法能够容纳包括寿命极短的不稳定烷基自由基在内的多种自由基中间体，以及含有不同官能团（如α,β-不饱和腈、酯、醛和酮）的自由基受体。通过整合多种不对称催化概念，成功获得了多种先前无法获得的产品，这些产品最多包含四个立体异构中心，并具有优异的非对映和对映选择性。该方法还适用于多样性导向的组合合成，突显了其在药物化学研究中的潜在应用。

图  吡哆醛脱羧酶催化三组分自由基C-C偶联的多样性导向光生物催化合成

三组分偶联酶的发现与定向进化

作者首先以苄基硼酸频哪醇酯（1a）、甲基丙烯腈（2a）和天冬氨酸（3a）为模型底物，筛选了一系列PLP依赖性脱羧醛缩酶变体。在特定光生物催化条件下，使用UstD L392G和玫瑰红（RB），成功合成了环化脒产物5a，并验证了双重光生物催化性质。为提高催化活性和非对映选择性，对UstD酶进行了定向进化。通过柔性环工程，筛选出T391A、M393W和L392Q等有益突变，获得三重突变体UstDAWQ。随后，通过S60G突变进一步提升了非对映选择性。最终，通过双位点饱和诱变，成功筛选出UstDAWMM)变体，其活性和非对映选择性均显著提高。UstDAWMM还能通过动力学拆分机制与外消旋天冬氨酸作用，同样获得高产率和立体选择性的产物。

图  有机硼酸盐、甲基丙烯腈和天冬氨酸的非对映和对映选择性光生物催化三组分自由基偶联

生物催化脒合成的底物范围

利用进化后的生物催化剂UstDAWMM，继续考察了其广泛的底物范围。结果表明，带有对位、间位和邻位取代基的苄基硼酸酯均能良好耐受，生成具有优异非对映和对映选择性的环状脒产物。包括氟、氯、溴在内的卤素官能团也兼容，且对给电子甲氧基和吸电子三氟甲基团也能适应，这表明酶对自由基中间体的电子性质具有广泛的耐受性。潜在的敏感官能团，如硫醚、氰基和甲基酯，也兼容，突显了光生物催化过程的温和反应条件。此外，吡唑、吡啶和噻吩等杂环也能有效转化。除了苄基自由基，该酶还能高效偶联烯丙基自由基和α-杂原子稳定自由基。更重要的是，不稳定的伯烷基自由基以及寿命短的仲烷基自由基（如环戊基和异丙基）也成功引入，获得了具有合成实用价值的产率，进一步强调了这种三组分自由基偶联卓越的底物普适性。

图  甲基丙烯腈立体选择性光生物催化三组分自由基C-C偶联的底物范围

其他α,β-不饱和底物的生物催化转化

进一步探索了将其他α,β-不饱和底物作为自由基受体应用于三组分自由基偶联。使用丙烯酸甲酯（2c）和UstDAWAS，通过精确调节反应pH值，可以选择性地获得非环化氨基酯或环化内酰胺，pH 8下得到氨基酯，pH 9下得到环化产物。该三组分偶联对α-取代丙烯酸酯（2d和2e）也有效。此外，α,β-不饱和醛和酮也是优异的底物，生成δ-氧代-α-氨基酸，其会自发进行分子内胺-羰基缩合形成相应的环状亚胺11。通过使用先前发现的亚胺还原酶（IRED），可将生成的环状亚胺产物转化为相应的多取代非天然脯氨酸，具有优异的非对映和对映选择性。

图  使用替代自由基前体和多酶级联的多样性导向的光生物催化合成

酶促非对映异构发散催化、动力学拆分和并行动力学拆分

为进一步展现酶对复杂三组分自由基偶联反应立体控制的强大能力，作者探索了三种额外的立体诱导机制。对于具有较大α-取代基的丙烯腈（2h），可以通过酶控方式以优异的立体控制获得任一非对映异构体产物，提供了酶控非对映发散自由基碳-碳键形成的罕见示例。针对非天然氨基酸底物DL-β-甲基天冬氨酸，通过酶促动力学拆分机制，只有特定立体异构体被 UstDAWLG 接受并转化，生成具有三个连续立体中心的立体明确产物，包括一个γ-位的季碳原子]。此外，本光生物催化三组分偶联反应中也实现了酶促并行动力学拆分，生成两种具有多个立体中心的对映富集产物。

图  利用各种不对称催化概念的光生物催化三组分偶联

组合生物催化实现多样性导向合成

鉴于当前光生物催化三组分自由基偶联反应异常宽泛的底物范围和结构多样的产物，作者探索了利用该平台进行多样性导向的组合酶促合成的可能性，并以文库形式进行。他们选择了10种结构多样的自由基前体和10种自由基受体，进行了10×10的组合生物催化实验。结果显示，86%的底物组合成功进行了光生物催化偶联，产生了适合进一步优化用于药物化学应用的反应“命中”产物。通过不同PLP酶变体的互补活性，总共覆盖了该10×10组合文库中99%的产物，其中44%的化合物以30-80%的收率获得。这些结果强调了酶工程在遍历广阔化学空间方面的巨大潜力，并为制药工业中的发现化学提供了新的途径。

图  以文库形式的光生物催化组合合成

酶-光催化剂关联及计算研究

为了深入了解光生物催化三组分偶联的机制，作者进行了光物理和计算研究。TEMPO捕获实验证实了当前三组分偶联的自由基性质。紫外-可见吸收光谱显示，在工程PLP酶UstDAWMM存在下，玫瑰红（RB）的吸收光谱发生红移，表明其微环境发生变化，暗示了光催化剂与生物催化剂的自发关联。荧光各向异性滴定实验确定RB和UstDAWMM形成1:1复合物，几乎100%的酶与RB紧密结合。这种自发关联机制有助于在酶活性位点附近定位自由基生成，使光氧化还原产生的自由基能够迅速被自由基受体捕获，并与酶稳定的PLP共价中间体有效反应。DFT计算表明，亲电性α-氰基自由基与PLP结合烯胺的极性匹配，确保了对电子缺陷的选择性自由基加成，激活能垒比苄基自由基加成低，解释了挑战性酶促三组分偶联的高化学选择性。MD模拟揭示，UstDAWMM活性位点中的M60、M392和W393侧链形成手性口袋，阻挡了烯胺的(Re)-面，并引导(Si)-面加成。对于主要的非对映异构体，MD模拟显示α-氰基团与H148的强氢键以及苯基团与W393和H283'侧链之间的π-π堆叠相互作用起到了稳定作用，而S60M、L392M和M393W突变不仅增强了与自由基的非共价相互作用，还缩小了手性口袋，实现了甲基和苯乙基之间的手性识别，从而提高了反应活性和立体选择性。

图  双光生物催化三组分自由基偶联的光物理和计算研究

展望

总之，本研究设计并开发了光生物催化三组分自由基C-C偶联过程，用于合成复杂氨基酸衍生物。改性自由基PLP酶的底物混杂性突破了生物催化限制，为有机化学和生物化学中的新催化反应提供了机会。其进化性和适应性解决了立体选择性难题，实现了酶促三分子反应，展现了酶促反应在制药工业中的巨大潜力。

参考文献：

CHEN ZHANG, et al. Diversity-oriented photobiocatalytic synthesis via stereoselective three-component radical coupling. Science.

DOI: 10.1126/science.adx2935