C-C偶联，最新Nature Catalysis！

米测MeLab

2026-04-10

第一作者：Jianlin Chun, Yuyan Bao, Qiaoyu hang, Xueli Hou

通讯作者：Jiahai Zhou(周佳海), Binju Wang(王斌举), Xiaoqiang Huang(黄小强)

通讯单位：南京大学、厦门大学、中国科学院深圳先进技术研究院、南京师范大学

研究要点

本研究首次将一类全新的硫胺素焦磷酸依赖型酶——苯甲酰甲酸脱羧酶与光氧化还原催化协同，成功实现了简单肉桂醛类底物与Katritzky盐之间的对映选择性和非对映选择性C(sp³)-C(sp³)键自由基交叉偶联。这一“新自然”反应能够高效构建含有β-或β,γ-手性中心的羧酸类化合物（图1）。通过定向进化，研究者获得了高性能变体RE1_csp3，在38个底物范围内实现了最高96%的对映体过量值和91:9的非对映体比例。系统的结构生物学、电子顺磁共振波谱及量子力学/分子力学计算研究表明，该反应的立体选择性源于酶活性口袋对两个前手性自由基中间体的精准空间约束与π-π堆积相互作用。

图1. 合成策略示意图

一、研究背景

在药物化学中，增加分子的三维立体性和饱和性是提高临床成功率的重要策略，因此含有多个C(sp³)手性中心的分子骨架备受关注。自由基C(sp³)-C(sp³)键的形成为此类分子的构筑提供了高效路径，但其核心挑战在于：如何实现两个前手性烷基自由基的化学选择性与立体选择性重组（图2）。传统的Giese反应虽能实现C–C键的远程构筑，但对前手性自由基的立体控制极为困难，通常需要依赖双齿配位底物或手性助剂。

近年来，酶催化因其卓越的选择性和可进化性而成为调控自由基反应的有力工具。Melchiorre和Saravanan团队分别报道了利用I类醛缩酶直接激发实现肉桂醛与自由基前体的Giese类型偶联，展示了酶对共价结合烯烃底物的立体控制能力。然而，这些体系仍依赖于立体专一的自由基前体，未能解决外消旋自由基前体的对映选择性识别问题。

图2. 利用酶催化简单肉桂醛形成C(sp3)–C(sp3)键

二、研究思路

1. 催化循环的重新设计与酶的选择

本研究团队设想，能否利用硫胺素依赖型酶的独特催化机制——即通过形成烯胺或烯醇中间体实现极性反转——来生成一个稳定的酶结合的自由基中间体，进而与另一个溶液中的前手性自由基发生立体选择性交叉偶联？为此，研究者选择了苯甲酰甲酸脱羧酶作为起点，因为其天然能够催化芳香醛的脱羧反应，且其活性位点具备容纳较大芳香族底物的潜力。

在设计的催化循环中（图3），肉桂醛首先与ThDP-derived卡宾中间体缩合，形成酶结合的乙烯基Breslow中间体（Int. II）。在绿色LED光照下，光敏剂罗丹明B被激发，通过单电子转移将该中间体氧化为持久的酶结合自由基（Int. III），同时生成的光催化剂自由基阴离子还原Katritzky盐，产生前手性苄基自由基（Int. IV）。随后，两个自由基在酶活性口袋内发生立体选择性重组，经水解后释放出手性羧酸产物。

图3. 设计与开发

2. 酶的筛选与定向进化

研究者首先测试了多种ThDP依赖型酶，发现野生型PfBAL和PpBFD均能催化模型反应，但PpBFD显示出更高的初始非对映选择性（d.r. 55:45）。为了进一步提升对映选择性和转化率，研究团队对PpBFD进行了四轮定向进化（图3c）。关键突变包括：A460G（提高活性）、L109F和T377L（显著增强立体选择性），以及后续的L403V和V483A等。最终获得的RE1_csp3变体（含A460G/L109F/T377L/L403V/V483A五个突变）在模型反应中实现了93%的产率、93% e.e.和91:9 d.r.。单晶X射线衍射分析（图6a）表明，L109F和T377L突变使活性口袋显著收缩（两残基距离从8.0 Å缩短至5.1 Å），从而对自由基中间体的空间取向施加了更严格的约束。

3. 性能评估与底物范围

在优化条件下，研究者首先考察了来自Katritzky盐的苄基自由基的普适性（图4）。结果显示，无论是给电子还是吸电子取代的芳环、杂环（如噻吩、苯并噻吩）以及稠环（如萘），均能以良好至优异的产率和对映选择性（最高96% e.e.）得到目标羧酸产物。值得注意的是，该体系能够兼容游离的羟基和醛基，展示了良好的官能团耐受性。

随后，研究者考察了不同取代的肉桂醛。苯环上不同位置的甲基、甲氧基、卤素以及萘环均能顺利反应，产率和对映选择性保持良好。更重要的是，该体系还能够实现β,γ-连续手性中心的构建：当使用γ-取代的肉桂醛时，反应以良好的非对映选择性（最高88:12 d.r.）和优异的对映选择性（最高98% e.e.）得到含有两个相邻C(sp³)手性中心的羧酸。X射线单晶衍射确定了代表性产物5a的绝对构型为(3S,4R)。

更具挑战性的是二级和三级苄基自由基的引入，因为其空间位阻更大且易发生异构化。通过对Katritzky盐的结构优化（引入吡啶甲酰基作为活化基团），研究者成功实现了二级和三级苄基自由基的偶联（图5）。尽管产率有所下降，但该体系仍能以中等的产率和优异的对映选择性（最高96% e.e.）得到含有季碳中心的羧酸产物。这进一步证明了酶活性口袋对自由基结构的强大容忍性和选择性控制能力。

图4. 含单个手性中心的C(sp3)–C(sp3)键光生物催化形成的底物范围

图5. 利用二级和三级苄基自由基进行C(sp3)–C(sp3)的立体选择性形成

4. 机理研究：从光谱到计算的多尺度验证

为验证所提出的自由基机理，研究者开展了系统的实验（图6b-d）。紫外-可见吸收光谱显示，RE1_csp3与肉桂醛混合后，在400–500 nm处出现新的吸收峰，归属于乙烯基Breslow中间体（Int. II）的形成。自由基捕获实验表明，加入TEMPO后反应完全被抑制，并检测到TEMPO-苄基加合物，直接证明了苄基自由基（Int. IV）的生成。更重要的是，低温电子顺磁共振波谱在完整反应体系中检测到一个有机自由基信号，其参数与模拟的酶结合自由基（Int. III）高度吻合，为酶结合自由基的存在提供了直接证据。

研究者进一步采用经典分子动力学和量子力学/分子力学计算深入剖析立体选择性的分子基础（图6e-g）。分子动力学模拟显示，苄基自由基（Int. IV）在活性口袋内可采取两种构象：“向下”和“向上”。在“向上”构象中，苄基自由基的苯环与酶活性位点的F464残基以及Int. III的噻唑环形成有利的π-π堆积作用，使得C1–C3（即远程C–C键形成）的距离更短（3.70 Å），且自旋密度分布更有利于反应。而在“向下”构象中，L377和L403残基对苄基自由基产生显著的位阻排斥，迫使其采取垂直取向，不利于偶联。

量子力学/分子力学自由能计算进一步定量地表明：从“向上”构象形成(R)-产物的能垒仅为1.9 kcal/mol，而从“向下”构象形成(S)-产物的能垒则高达5.5 kcal/mol。这一能量差（3.6 kcal/mol）与实验测得的93% e.e.值（对应约2.0 kcal/mol的能垒差）在趋势上高度一致。更为重要的是，计算还揭示了区域选择性的来源：C1–C3（远程偶联）的能垒显著低于C1–C1（ipso-偶联）的能垒（例如，在“向上”构象中分别为1.9和12.4 kcal/mol），这解释了为何反应专一地生成远程C(sp³)-C(sp³)键而非此前报道的ipso-偶联产物。

图6. 机制研究

三、小结

本研究通过协同利用光氧化还原催化和一类未被开发的硫胺素依赖型酶——苯甲酰甲酸脱羧酶，成功实现了简单肉桂醛与Katritzky盐之间高度对映选择性和非对映选择性的远程C(sp³)-C(sp³)键自由基交叉偶联。这一“新自然”转化不仅显著拓展了ThDP依赖型酶的反应类型，也为解决自由基化学中长期存在的立体选择性控制难题提供了全新的生物催化方案。

该工作的核心科学贡献在于：首次将ThDP依赖型酶的催化范式从传统的双电子极性反应拓展至单电子自由基反应，并实现了对两个前手性自由基的立体区分。通过定向进化与多尺度机理研究的紧密结合，研究者清晰地揭示了酶活性口袋如何通过空间位阻和π-π堆积相互作用精准控制两个自由基的相遇取向，从而实现对映选择性和区域选择性的双重控制。这一策略为未来设计更多类型的自由基生物催化体系、构建含有连续手性中心的复杂药物分子开辟了崭新的道路。

原文详情：

Jianlin Chun et al. Enantioselective C(sp³)-C(sp³) bond formation by synergistic thiamine-dependent radical biocatalysis and photoredox catalysis. Nature Catalysis (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41929-026-01515-w