冷冻电镜新应用：微电子衍射技术确定小分子结构
巩伟
研究亮点：
报道了一种冷冻电镜(cryoEM)方法——微电子衍射(MicroED)技术用于对有机小分子进行简便、准确的结构测定。
分子结构测定技术的发展及挑战
分子结构的测定在化学的发展历程中一直以来都占有极其重要的地位。好奇心驱动着化学家们不断追求更精确的分子结构测定方法。在过去的一百多年里，化学家们已经开发出多种测定分子结构的技术手段，比如旋光、紫外、红外、圆二色谱和质谱等，极大的促进了合成化学的发展。但这些技术对更精确的分子结构确定仍然无能为力。直到五十年前，核磁技术的开发与应用为有机化学家们带来了曙光，可以说，核磁技术颠覆了人们对于分子结构的认知，不论在传统的合成化学领域还是现代化学中更为复杂的天然产物化学中都发挥出了举足轻重的作用。
随着伦琴发现了X射线以及劳埃发现了X射线衍射现象，人们认识微观世界的手段被极大丰富，在发展了近百年的今天，其重要性依旧，在化学、分子生物学、药学、物理学以及材料学等领域发挥了重要作用。单晶X-射线衍射技术的优点在于其可以提供极为精确的结构信息，包括晶胞参数、精系、空间群、原子的三维分布、成键、电子分布、分子构型和构象以及绝对构型等一系列信息，准确直观，具有极强的权威性。
然而，单晶X-射线衍射技术的使用前提是需要合适的高质量单晶，而要想获得符合要求的单晶，不仅需要大量的实验技巧，而且往往伴随着一定的运气。因此，尽管该技术提供的结构信息目前来说是远远超越其它表征手段的，但是如何对一些难以形成单晶的分子进行快速准确的结构测定仍然是亟待解决的难题。
成果简介
有鉴于此，加州大学洛杉矶分校Hosea M. Nelson、Jose A. Rodriguez、Tamir Gonen以及加州理工学院Brian M. Stoltz等人报道了一种微电子衍射技术(MicroED)（一种冷冻电镜方法）用于有机分子的结构确定。
该方法理论上仅需要极少量(10-15 g)样品，制样和测试过程方便，且对样品要求不高，甚至经过硅胶柱提纯的样品都可以直接用于测试。最重要的是该手段可以获得高于1 Å的原子级分辨率，可以精确的确定各原子的位置以及键长键角等信息。该技术有望进一步促进合成化学、天然产物化学以及药物化学等领域的发展。
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要点1：微电子衍射技术实验流程
以天然的类固醇类化合物黄体酮的分子结构测定为例，如图1所示，将粉末状的黄体酮样品直接从样品瓶中取出置于玻璃片上，再用另一片玻璃片摩擦使样品均匀分散，再转移至多洞的碳铜网上，将其冷却至液氮温度，在200 KV的加速电压下，用低温显微镜进行观察发现有几千个样品颗粒可供选择测试。通常来说，绝大部分的样品颗粒均可以获得分辨率高于1 Å的衍射数据。
图1. 应用微电子衍射技术(MicroED)对小分子进行结构分析的流程。
通过不断的旋转样品台，可以收集到140度的衍射数据。一般来说，样品台的旋转速度为0.6度每秒，因此收集一套完整数据的时间约为3分钟左右。再通过XDS软件即可对数据进行解析。总的来说，从样品制备到数据收集完成，仅需30分钟左右。
要点2：各类样品中的结构解析
同时，该技术也被用来测定更多更复杂天然产物分子的分子结构，如图2A所示，均获得了较好的分辨率，从而表明了该技术在确定分子结构上的普适性。进一步，对于一些仅能通过硅胶色谱分离的分子来说，是否可以通过该技术来测定其分子结构呢？答案是可以的。如图2A中的样品10 和11，它们均是通过柱色谱分离后旋干获得的粉末，利用该技术均可以获得较好的分辨率，甚至还可以获得明确的氢原子位置信息(图2C)。
图2. 微电子衍射技术(MicroED)解析出的不同类型的小分子。
在确定物质分子结构的过程中，最为困难的是对样品的提纯。无论是早期的分子结构确定技术还是现代的X-射线单晶衍射技术，均需要样品具有极好的相纯度。而在微电子衍射技术中，不仅对样品的纯度并没有很高的要求，甚至可以在一次操作中确定混合物中的各组分的精确结构。如图3所示，将样品4,6,8,9混合制样，对样品分别收集数据，即可获得四套独立的数据，从而解析获得四套独立的分子结构。
图3. 异相混合物样品中各组分结构的确定。
小结与展望
微电子衍射技术(MicroED)最早是用来获得蛋白质样品原子级分辨率的技术手段，现在被证明可以用于小分子以及复杂天然产物分子的结构测定。被测样品仅需在极低密度的电子束(通常小于0.01 e-/Å2/s)照射下即可获得较为理想的衍射数据，时间快，对样品的损伤很小，具有极好的应用前景。未来有望进一步拓展并用于多维复杂分子如多孔有机聚合物(POPs)，共价有机框架(COFs)以及金属-有机框架(MOFs)等的结构测定。
参考文献：
ChristopherG. Jones, Michael W. Martynowycz, Johan Hattne, Tyler J. Fulton, Brian M.Stoltz, Jose A. Rodriguez, Hosea M. Nelson, and Tamir Gonen. The CryoEM MethodMicroED as a Powerful Tool for Small Molecule Structure Determination. ACS Central Science, 2018.
DOI: 10.1021/acscentsci.8b00760
https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/abs/10.1021/acscentsci.8b00760
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